在NCBI利用Primer |
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用微信扫码二维码 分享至好友和朋友圈 Primer-BLAST,在线设计用于聚合酶链反应(PCR)的特异性寡核苷酸引物。这个工具整合了Primer3软件,再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。将设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。 Primer-BLAST可以从两种途径进入: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 小编此前发布这篇,就看到很多粉丝在后台上留言,问怎样在NCBI上设计出引物呢?所以下面小编为大家讲讲用primer-blast设计引物。 Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分:target template(模板区)、primers(引物区)和specificitycheck(特异性验证区)。跟其它的BLAST一样,点击底部的“Advancedparameters”有更多的参数设置。 target template 在“PCR Template”下面的文本框,输入目标模板的序列、FASTA格式或Accession Number。如果你在这里输入了序列,是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物,并且在目标数据库(在specificity check区选择)是唯一的。 primer 引物是一段短的单链寡核苷酸,在PCR过程的退火阶段可与单链模板结合,DNA聚合酶沿着引物的3‘末端向后进行DNA合成。引物与模板的结合遵循碱基互补配对的原则,所以当退火温度不合适或引物设计不合理时,引物会结合到模板的非目标区域,从而导致其他片段的扩增。 如果你已经设计好了引物,要拿来验证引物的好坏,可以在Primer Parameters区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库(在specificity check区选择)。根据需要可设置产物的大小、Tm值等。 specificity check 先讲讲引物的特异性,那就是引物结合模板正确位置的能力,或者避免结合非目标位置的能力。影响引物特异性的因素包括引物长度、GC含量、碱基分布、Tm值等。 在specificity check区,选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。 这里提供了4种数据库: RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies) Genome (all chromosomes) nr (the standard non-redundant database) 当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时,Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。 selected reference assemblies 包括以下的物种:human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。 EXAMPLE 人尿嘧啶DNA糖基化酶的两个转录本序列 uracil-DNA glycosylase genes, UNG, GeneID: 7374 UNG1的accession number: NM_003362 UNG2的accession number: NM_080911 这里用UNG1的序列设计引物,选择RefSeq mRNA database,物种是Homo sapiens,其它默认。 把“Allow primer to amplify mRNA splice variants”这个选项给勾上. 结果如下图所示: 小贴士 一定要指定一个或几个PCR扩增的目标物种。 在任何时候都要优先使用参考序列的Gi number或Accession number。 如果对某条染色体上的某个区域感兴趣,都要先优化使用Gi number或Accession number,况且在Primer-BLAST可以设置引物设计的参数。 尽量使用没有冗除的数据库(如refseq_rna 或 genome database)。 E N D 欢迎点赞、加关注 南博屹相伴,科研不孤单 特别声明:以上内容(如有图片或视频亦包括在内)为自媒体平台“网易号”用户上传并发布,本平台仅提供信息存储服务。 Notice: The content above (including the pictures and videos if any) is uploaded and posted by a user of NetEase Hao, which is a social media platform and only provides information storage services. /阅读下一篇/ 返回网易首页 下载网易新闻客户端 |
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