BLAST是“局部相似性基本查询工具”(Basic Local Alignment Search Tool)的缩写，是由美国国立生物技术信息中心(NCBI)开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序,是目前最常用的数据库搜索程序。

BLAST实际是综合在一起的一组工具的统称，它不仅可用于直接对核酸序列数据库和蛋白质序列数据库进行搜索，而且可以将带搜索的核酸序列翻译成蛋白质序列后再进行搜索，或反之，以提高搜索效率。

常用BLAST分类:

标准BLAST：Blastn、Blastp、Blastx、tBlastn、tBlastx

BLASTp根据搜索算法分：标准BLASTp、PSI-BLAST、PHI-BLAST

注：这里记录的是Blast+的简介、安装与使用，旧版的blast不完全适用。

BLAST基本原理很简单，它的要点是片段对的概念。所谓片段对是指两个给定序列中的一对子序列，它们的长度相等且可形成无空位的完全匹配。

图 1-A 中方框里的就是两个片段对。BLAST 从头至尾将两条序列扫描一遍并找出所有片段对，并在允许的阈值范围内对片段对进行延伸，最终找出高分值片段对（high-scoring pairs, HSPs）（图 1-B）。这样的计算复杂度是 n 的一次方（n 是序列的长度）。如果做双序列比对话需要构建一个 n 乘以 n 的表格，计算复杂度是 n 的二次方。所以找高分值片段对比做双序列比对节省了大量的时间，当然，前提是牺牲了一定的准确度。另外，如今改进后的BLAST允许空位的插入。

为什么是按 6 条链翻译？

在无法得知翻译起始位点在情况下，翻译可能是从第一个碱基开始，三个三个的往后翻译，也可能是从第 2 个碱基开始，也可能从第 3 个碱基开始。另外还有可能是从这条链的互补链上开始，这样又有三个可能的开始位置，加起来一共会产生 6 条可能被翻译出来的蛋白质序列。这 6 条中有些是真实存在的，有些是不存在，但是谁真谁假我们无从知晓，所以 6 条序列都要到数据库中去搜索一下试试。

①PSI-BLAST(Position-Specific Iterated BLAST，位点特异性迭代BLAST)

PSI-BLAST的特色是每次用位置特异权重矩阵(Position-Specific Scoring Matrix，PSSM)搜索数据库后再利用搜索的结果重新构建PSSM，然后用新的PSSM再次搜索数据库，如此反复(iteration)直至没有新的结果产生为止。

②PHI-BLAST(Pattern-Hit Initiated BLAST，模式识别BLAST)

PHI-BLAST能找到与输入序列相似的并符合某种特定模式(Pattern)的序列，这种序列特征模式可能代表某个翻译后修饰的发生位点，也可以代表一个酶的活性位点，或者一个蛋白质家族的结构域、功能域。

网络版：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

单机版：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST

(1)网络版

包括NCBI在内的很多网站都提供了在线的BLAST服务，这也是我们最经常用到的BLAST服务。网络版本的BLAST服务有方便，容易操作，数据库同步更新等优点。但是缺点是不利于操作大批量的数据，同时也不好自己定义搜索的数据库。另外分析时使用的服务器遥远，加上全球可能同时大量人员使用，所以使用NCBI的网络版BLAST，分析时间可能会很长，甚至会卡死中断。

(2)单机版

单机版的BLAST可以通过NCBI的ftp站点获得，有适合不同平台的版本(包括Linus，DOS等)。获得程序的同时必须获取相应的数据库才能在本地进行BLAST分析。单机版的优点是可以处理大批的数据，可以自己定义数据库，但是需要耗费本地机的大量资源，此外操作也没有网络版直观、方便，需要一定的计算机操作水平。

使用如viroBLAST和Sequenceserver(http://www.sequenceserver.com)软件包，用户可以建立一个简易的进行BLAST运算的网站供实验室人员使用，该网站相当于NCBI-BLAST（ncbi-blast+）的前端图形交互界面。

(1)Score:使用打分矩阵对匹配的片段进行打分，这是对各氨基酸残基(或碱基)打分求和的结果，一般来说，匹配片段越长、相似性越高则Score值越大。

(2)E-value:在相同长度的情况下，两个氨基酸残基(或碱基)随机排列的序列进行打分，得到上述Score值的概率的大下。E值越小表示随机情况下得到该Score值的可能性越低。

(1)Windows平台

①程序下载：

访问BLAST本地软件包下载链接(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST)，下载适合自己电脑的BLAST win版本。

②安装：

下载完毕后，双击安装到指定位置(如：C:\Blast)，生成bin和doc两个子目录，其中bin是程序目录， doc是文档目录，这样就安装完成。

③环境变量设置：

右键点击“我的电脑”-属性，然后“高级系统设置”选项-“环境变量”，在用户变量下方点击“新建”-变量名：BLASTDB，变量值：C:\Blast\db(即数据库路径)。在系统变量下方“Path”添加变量值：C:\Blast\bin。

④查看程序版本信息：

点击window的"开始"菜单，在运行中输入cmd，调出MS-DOS命令行，输入命令cd C:\Blast\bin转到BLAST安装目录，输入命令 blastn -version即可查看版本。

注：以上涉及的地址需要按照自己电脑BLAST安装的位置进行设定。

(2)Linux平台

①下载：

②解压：

③重命名(为方便使用和统一管理)：

④环境变量设置：

将BLAST+可执行程序所在目录（bin）的绝对路径加入到环境变量$PATH中，以方便通过程序名直接调用。

编辑~/.bashrc文件，在最后加入以下行：

如果不会使用vi/vim等编辑器，可直接运行下列一行命令，将上述内容添加到~/.bashrc文件（看清楚，和上面不同的是：$被转义了的）：

⑤让配置生效：

source ~/.bashrc

到此，你就可以直接输入BLAST的子程序，如blastn进行比对了。输入blastn –version可查看版本信息。

以上涉及地址需要按照自己电脑BLAST安装位置进行设定，由于NCBI会更新BLAST+，所以以上命令在下载时需要查看当时的版本信息而进行相应的修改。

(1)数据格式化(检索库的建立)

①格式化命令：

②主要参数说明：

-in参数后面接将要格式化的数据库；

-parse_seqids, -hash_index两个参数一般都带上，主要是为blastdbcmd取子序列时使用；

-dbtype 后接所格式化的序列的类型，核酸用 nucl，蛋白质用prot；

-title 给数据库起个名(不能用在后面搜索时-db的参数)；

-out 后接数据库名，自己起一个有意义的名字，后面比对搜索时要用到的-db的参数；

-logfile 日志文件，如果没有默认输出到屏幕。

(2)BLAST序列比对

①序列比对命令：

例：核酸序列比对蛋白数据库:

蛋白序列比对蛋白数据库:

②主要参数介绍：

-query： 输入文件路径及文件名；

-out：输出文件路径及文件名；

-db：数据库路径及数据库名；

-task： 共五个程序选择'blastn' 'blastn-short' 'dcmegablast' 'megablast' 'rmblastn' ，默认megablast；

具体区别如下：

blastn 完全匹配的传统blastn；

blastn-short 优化查询：短于50个碱基；

megablast 查找十分相似的序列（如物种内部或相关的物种间）；

dc-megablast 查找亲缘关系比较远的序列（如物种间）；

rmblastn 兼容了RepeatMasker。

-evalue：设置输出结果的e-value值，一般1e-5；

-num_threads：线程数，笔记本不要设大了，２就够了；

-num_alignments：输出数据库中能与Query比对上的的序列数目，与max_target_seqs不能同时使用；

-max_target_seqs：最多允许比对到数据库中的序列数目，参数仅适用于outfmt >4；

-perc_identity ：比对的最低相似度；

-max_hsps：由于不对时一条序列比对成多段，如果只想输出其中的几段，就设定相应的数目，与-num_alignments不能同时使用；

-outfmt：输出文件格式，总共有15种格式，一般设置为６。6是tabular格式对应BLAST的m8格式；

0 = pairwise,

1 = query-anchored showing identities,

2 = query-anchored no identities,

3 = flat query-anchored, show identities,

4 = flat query-anchored, no identities,

5 = XML Blast output,

6 = tabular,

7 = tabular with comment lines,

8 = Text ASN.1,

9 = Binary ASN.1,

10 = Comma-separated values,

11 = BLAST archive format (ASN.1),

12 = JSON Seqalign output,

13 = JSON Blast output,

14 = XML2 Blast output。

此外还能自定义输出格式主要针对上述的 6, 7, and 10三种格式。

③outfmt 6输出12列对应的含义：

Query id：查询序列ID标识；

Subject id：比对上的目标序列ID标识；

% identity：序列比对的一致性百分比；

alignment length：符合比对的比对区域的长度；

mismatches：比对区域的错配数；

gap openings：比对区域的gap数目；

q. start：比对区域在查询序列(Query id)上的起始位点；

q. end：比对区域在查询序列(Query id)上的终止位点；

s. start：比对区域在目标序列(Subject id)上的起始位点；

s. end：比对区域在目标序列(Subject id)上的终止位点；

e-value：比对结果的期望值，解释是大概多少次随即比对才能出现一次这个score,Evalue越小，表明这种情况，从概率上越不可能发生，但是现在发生了，所以这个比对具有很重要的意义；

bit score：比对结果的bit score值。bit score值表示对齐的好坏;分数越高，对齐效果越好。一般来说，这个分数是根据一个公式计算出来的，这个公式考虑了相似或相同残基的排列，以及为了排列序列而引入的任何gaps。

(1)序列比对

①进入BLAST网页，选择需要使用的BLAST

②输入查询序列

除了可以输入单条序列，还可以通过上传文件进行多条序列的比对。

③选择搜索的数据库

(2)比对结果查看

第一部分搜索任务描述部分。输入界面里设置的各种参数都会在这里列出。

第二部分（Descriptions）是高分匹配片段所在序列的详细信息列表。每条序列都有一个匹配得分和覆盖度。这两项决定了第二部分彩图中每条线的颜色和长短。除了匹配得分和覆盖度，表中还列出了其他指标。尤为重要的是 E-value。E-value 也叫做期望值或 E值。E 值越接近零，说明输入序列与当前这条序列为同一条序列的可能性越大。第三部分的表就是根据 E 值由低到高排序的。随着 E 值增大，匹配得分是成反比逐渐降低的。但是一致度与 E 值并非完全成反比。因为我们在前面讲 BLAST 核心思想的时候说过，BLAST 没有做双序列比对，为了提高速度，它牺牲了一定的准确度。表中的一致度，是 BLAST 搜索完成后，针对搜索到的这几条序列专门做双序列比对而得到的。BLAST 牺牲掉的准确度对高度相似的序列，也就是亲缘关系近的序列构成不了威胁，不会把它们落掉，但是对于那些只有一点点相似，也就是远源的序列，就有点麻烦了，它们很有可能被丢掉而没有被 BLAST发现。

第三部分（Graphic Summary）是图形化搜索结果部分。在图形化搜索结果里，BLAST结果图形显示相似度颜色图(黑、蓝、绿、粉红、红，相似度由低到高)。

第四部分（Alignments）是比对的详细信息。

第五部分（Taxonomy）是比对上的物种分类学信息。