CRISPR文库筛选-基因筛选思路

在过去的几年中，CRISPR技术成为了生物领域中的一颗新明珠，CRISPR文库筛选作为其中的一种应用，建立目标物种的全基因组敲除库或与特定功能相关的基因敲除库，通过功能性筛选和富集及后续PCR扩增和深度测序分析，发掘与筛选表型相关的基因。基于CRISPR文库筛选的这种高通量功能性筛选技术也逐渐取代了RNAi和cDNA文库，为功能基因的研究提供了高通量高效率的筛选工具。

常见的CRISPR sgRNA文库筛选应用如下：

探索药物作用机制：药物靶点确定与验证

寻找肿瘤治疗靶点：上下游调控机制分析

探究代谢疾病治疗机制：代谢通路调节机制分析

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下面，小编挑选了3个比较典型的应用案例，与大家一起解读分析。

一、通过CRISPR文库筛选获得肝细胞癌治疗新靶点

肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌类型，具有表型和分子异质性的特征。HCC的高死亡率是由于缺乏适合早期检测的生物标志物、对HCC异质性的了解不足以及治疗耐药性。HCC的癌症干细胞（CSCs）被认为是负责启动异质性肿瘤病变，并导致肿瘤复发、转移和治疗耐药性的。目前，基于表面和细胞诊断标志物的肝脏CSCs的鉴定在肝脏CSCs的鉴定方面取得了非凡的进展。然而，CSCs也可以在不表达这些标记物的细胞群中被识别出来。因此，了解CSCs出现和扩张的详细调控机制，为改善HCC患者的预后提供了机会。

通过在来自HCC细胞的肿瘤球中进行CRISPR/Cas9代谢基因敲除文库筛选，发现敲除SCARB2抑制了HCC细胞的癌症干细胞样特性。在myc驱动和DEN（二乙基亚硝胺）诱导的HCC小鼠模型中，在肝细胞中敲除Scarb2可以减弱HCC的起始和进展。SCARB2与MYC的结合通过干扰hdca3介导的MYC对赖氨酸148的去乙酰化来促进MYC的乙酰化，从而增强MYC的转录活性。FDA（食品和药物管理局）批准的药物数据库的筛选显示，多粘菌素B对SCARB2蛋白表现出高亲和力，破坏SCARB2-MYC相互作用，降低MYC活性，并降低肿瘤负担。我们的研究确定了SCARB2是HCC的功能驱动因素，说明多粘菌素b的治疗可以作为HCC的靶向治疗选择。

图1|SCARB2 may perform critical pathogenic functions by supporting stem cell-like characteristics in HCC cells

二、文库筛选帮助解密癌症治疗的免疫逃逸

免疫检查点抑制剂治疗彻底改变了癌症治疗，但有些癌症，如急性髓系白血病（AML），没有反应或产生耐药性。一种潜在的免疫逃避机制，涉及异常的主要组织相容性复合体MHC-I类分子抗原呈递异常，从而影响杀伤性CD8 T细胞的数量及其功能，从而实现免疫逃逸。

图2|肿瘤抗原提呈相关分子的CRISPR筛选

急性髓系白血病 (AML)细胞起源于可以分化为抗原递呈细胞的髓系细胞，在这些细胞系上发现的抗原递呈机制很有可能存在于其他肿瘤类型。研究人员使用peptide-MHC-I-guided CRISPR文库对AML细胞进行筛选，在筛选过程中，研究人员发现了排名靠前的负调节因子包括表面蛋白sushi domain containing 6 (SUSD6)，跨膜蛋白127 (TMEM127)，以及E3泛素连接酶WWP2。其中，TMEM127为四次跨膜蛋白，与神经内分泌肿瘤易感相关，也被认为是一种Nedd4家族E3连接酶适配器，在沙门氏菌效应蛋白SteD存在下降解MHC II。SUSD6为单次跨膜蛋白，免疫相关功能未见报道。

SUSD6和TMEM127两个膜分子可以同时与MHC-I直接相互作用，并招募E3泛素连接酶WWP2，从而形成一个四元复合物。WWP2在SUSD6和TMEM127存在的情况下介导了MHC-I泛素化以及溶酶体降解，从而降低了MHC-I在细胞表面的表达。

结合与癌症生存率呈负相关的SUSD6/TMM127/WWP2基因特征，发现这些调控MHC-I类分子的关键基因是白血病和实体癌的潜在治疗靶点，对临床应用具有很大的价值。

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三、通过文库筛选获得白血病治疗新思路

分化治疗已被认为是急性髓系白血病（AML）的有效治疗策略；因此，开发多种适用AML治疗的方法是一个很重要的方向。虽然FOXOs转录因子是分化治疗的一个很有前途的药物靶点，但FOXO抑制剂在体内的疗效有限。在这里，作者发现（FOXO）家族成员的一个共同的顺式调节元件的药理抑制成功地诱导了各种AML细胞系的细胞分化。通过基因表达谱分析和基于分化标记基因的CRISPR/Cas9筛选，筛选到了TRIB1，COP1泛素连接酶复合物的补体，作为一个保持未分化状态的功能性FOXO下游基因。TRIB1是FOXO3的直接靶点，TRIB1启动子中的FOXO结合顺式调节元件，即TRIB1启动子中的FOXO响应元件（FRE-T），在分化阻断中发挥了关键作用。发现靶向FOXO家族的顺式调节元件是一种诱导AML细胞分化的治疗策略。

通过FOXO1抑制剂下调TRIB1有助于AML细胞的分化，鉴定TRIB1基因转录的顺式调控元件，以维持AML细胞的未分化状态。

本研究通过CRISPR文库，对30个基因进行筛选，以确定AML分化阻断的关键基因。并对关键基因进行验证为白血病治疗提供了新的思路和方法。www.edgene.cn

参考文献：

1. SCARB2 drives hepatocellular carcinoma tumor initiating cells via enhanced MYC transcriptional activity

2. A membrane-associated MHC-I inhibitory axis for cancer immune evasion

3. Targeting cis-regulatory elements of FOXO family is a novel therapeutic strategy for induction of leukemia cell differentiation