原标题：miRNA：miR-223 靶向 RASA1调节RAS/MAPK信号通路

看点：ncRNA机制挖掘及论证，揭示 MicroRNA-靶标mRNA互作调控机制。

关键词：

RASA1：RAS p21 GTPase-activating protein 1，有助于调节 RAS/MAPK 信号通路，调节细胞的生长，增殖，分化等。已有许多报道该基因在多种癌组织中特异性低表达。

小G蛋白Ras激活周期 图例：

Inactive：未激活态, 结合GDP。

Active:激活态, 结合GTP。

GEF：G因子交换因子，

GAP：GTPase活性蛋白，通过催化Ras-GTP脱磷酸为Ras-GDP，封闭Ras的活性。RASA1：为特异的GAP。

MAPK细胞膜段信号的激活通过GEF传递到Ras。

MAPK细胞膜内段的Ras信号的“失活”是由于GAP对Ras-GTP的脱磷酸作用。

MAPK细胞质内部的信号的放大依靠激活的Ras-GTP引导下游。

H-Ras为天然突变后“不与GAP互作被阻遏的”组成型激活状态。

RASA1：RAS p21 GTPase-activating protein 1，有助于调节 RAS/MAPK 信号通路，调节细胞的生长，增殖，分化等。已有许多报道该基因在多种癌组织中特异性低表达。

小G蛋白Ras激活周期 图例：

Inactive：未激活态, 结合GDP。

Active:激活态, 结合GTP。

GEF：G因子交换因子，

GAP：GTPase活性蛋白，通过催化Ras-GTP脱磷酸为Ras-GDP，封闭Ras的活性。RASA1：为特异的GAP。

MAPK细胞膜段信号的激活通过GEF传递到Ras。

MAPK细胞膜内段的Ras信号的“失活”是由于GAP对Ras-GTP的脱磷酸作用。

MAPK细胞质内部的信号的放大依靠激活的Ras-GTP引导下游。

H-Ras为天然突变后“不与GAP互作被阻遏的”组成型激活状态。

结论：在结直肠癌细胞系中转录因子 C/EBP-β 通过增强 pri-miR-223 启动子活性促进 miR-223 的表达，从而抑制 RASA1 蛋白的合成。

结果展示：

A. 构建 RASA1-3'UTR 的野生型(WT)和突变型（mutant）荧光素酶报告基因的克隆。在Caco-2细胞中，分组合后分别与 Pre-ncRNA，Pre-miR-223，Anti-ncRNA 和 Anti-miR-223 进行共转染，48h 后通过检测报告基因荧光素酶活性，以分析3'UTR区段的"突变与否"和“ Pre-ncRNA，Pre-miR-223，Anti-ncRNA 和 Anti-miR-223”等互作的功能。

结果分析：WT 在 Pre-lncRNA 和 Anti-lncRNA 细胞荧光素酶活性无明显变化，在 Pre-miR-223 相比于 Pre-ncRNA 的荧光素酶报告基因活性显降著降低，在 Anti-miR-223 相比 Anti-ncRNA 的荧光素酶报告基因活性显著升高；有趣的是，当 RASA1-3 ‘UTR 的突变后，在 Pre-miR-223 和 Anti-miR-223 细胞中，荧光素酶报告基因活性相较于WT组，荧光素酶活性呈恢复。

结论：在Caco-2细胞中 miR-223 与 RASA1-3'UTR 存在互作关系。

B. 通过 western blot 实验，检测过表达 Pre-ncRNA，Pre-miR-223，Anti-ncRNA 和 Anti-miR-223 情况下的 Caco-2 & HT-29 细胞中 RASA1 蛋白的表达情况。

结果分析：过表达 Pre-miR-223 的结直肠癌细胞系中，RASA1 蛋白表达显著降低，而过表达 Anti-miR-223 的细胞系，RASA1 蛋白表达显著升高。

结论：在结直肠癌细胞系中 miR-223 抑制 RASA1 蛋白的表达。

C. 通过 qRT-PCR 实验，检测过表达 Pre-ncRNA，Pre-miR-223，Anti-ncRNA 和 Anti-miR-223 的 Caco-2 和 HT-29 细胞的 RASA1 基因的转录水平。

结果分析：各组细胞的 RASA1 基因的转录水平基本无变化。

结论：在结直肠癌细胞系中 miR-223 不影响 RASA1 基因的转录。

D. 通过 qRT–PCR 实验，分别检测正常结直肠组织（NAT）与结直肠癌组织（CRC）中C/EBP-β 的转录水平。

结果分析：CRC中 C/EBP-β mRNA 表达情况明显高于正常结直肠组织。

结论：C/EBP-β mRNA在结直肠癌中显著性高表达。

E. pGL3-miR-223 克隆“插入片段”示意图（插入片段：pri-miR-223 启动子区）

F. 在Caco-2细胞中，分别共转染 pGL3-miR-223 与 PcDNA3.1，PcDNA3.1-C/EBP-β，Control-siRNA 和 C/EBP-β-siRNA，通过荧光素酶报告基因检测 pri-miR-223 启动子活性。

结果分析：与对照组比较，过表达 C/EBP-β 后，pri-miR-223 启动子活性显著升高；但是，敲减 C/EBP-β 的表达后，pri-miR-223 启动子活性显著降低。

结论：C/EBP-β与miR-223的表达呈正相关。

G. 通过 qRT–PCR 实验，检测过表达和敲减 C/EBP-β 基因后，miR-223的表达情况。

结果分析：结果与 F 结果相呼应：

结论：C/EBP-β通过增强 pri-miR-223 启动子活性，从而正调控 miR-223 的表达。

H. 通过 western blot 实验，检测过表达和敲减 C/EBP-β 基因后，RASA1 蛋白表达情况。

结果分析：过表达 C/EBP-β 导致了RASA1蛋白的表达显著降低；敲减C/EBP-β 导致了 RASA1蛋白的表达显著升高。

结论：在结肠癌细胞中 C/EBP-β 通过增强 pri-miR-223 启动子活性促进 miR-223的表达，从而抑制 RASA1 蛋白的合成。

材料来源：BJC British Journal of Cancer 2015

C/EBP-β-activated microRNA-223 promotes tumour growth through targeting RASA1 in human colorectal cancer

Fig3. Identification of miR-223-targeting RASA1 and activation mechanism of miR-223 in CRC cells.

小G蛋白激活的下游生物学功能总结：

小G蛋白激活的下游生物学功能总结：

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