microRNA(miRNA)是一类在转录后具有活性的小RNA(19~25个核苷酸)。它们是由发夹状的内源性miRNA前体产生，这些miRNA前体是从非蛋白质编码基因转录而来的。现有研究表明，动、植物来源的miRNA可在一定程度上被人体吸收并发挥其相应的作用。

miRNA与靶基因的互补关系，在很大程度上决定了miRNA的广泛功能。一般来说，与miRNA完全互补的靶基因将通过RNA干扰机制被降解；而部分互补的靶基因会受到翻译抑制[1]。在植物中，miRNA和蛋白质编码基因之间的互补形式以完全互补为主，而在哺乳动物中，部分互补更为常见。miRNA参与多种功能基因的调控，涉及植物细胞和哺乳动物细胞的增殖、分化和凋亡。miRNA通过促进或抑制靶mRNA的切割或翻译来介导转录后的基因调控，其在几乎所有的生物学过程中都发挥着关键作用，包括新陈代谢和免疫功能。自miRNA在秀丽隐杆线虫中首次被发现以来, 在所有的植物、动物和其他真核生物中都接连发现了数以千计的miRNA。

一直以来，对miRNA的研究都局限在植物和动物各自的物种内，且miRNA具有不稳定、易降解的特征，因此miRNA的跨界调控被认为十分困难。且也仅存在于植物与昆虫、动物与寄生虫之间。但近年来这些观点被打破，发现植物miRNA和动物miRNA可以进入人体内并发挥调控作用，这提示miRNA可能是药用动、植物发挥疗效的物质基础，可能是药用动、植物中隐藏的生物活性成分之一。但因其实验重复性差，所以目前仍存在争议。

植物miRNA在生物学功能上往往比动物miRNA更有效。因为植物缺乏有效的免疫系统，因而需要对环境压力和外部攻击做出更快、更有效的反应，所以植物发展出了比动物更有效的生长和防御机制。本文就植物miRNA特别是药用植物miRNA经口服吸收，并参与人体基因表达调控的关键环节予以分析讨论。

随着对miRNA的不断研究，植物药miRNA的治疗潜力引起了极大的关注。但中药的制备多以煎煮成的汤药为主，miRNA在制备过程中结构能否保持稳定十分关键。

Xie等[2]对槲寄生miRNA在药材制备过程中的稳定性进行了研究。一些槲寄生miRNA经研磨、干燥、储存和浸泡后仍存在，并且能在浸泡液中被检测到。他们发现，暴露于核糖核酸酶、超声波处理和热处理可能是miRNA降解的主要原因。机械处理会增加miRNA的分解，而可能不会促进miRNA向溶剂中的释放。植物miRNA的甲基化可能会增强它们的抗降解能力，而与蛋白质和纳米颗粒等植物来源的大分子结合可能在草药制备过程中能更有效的保护植物miRNA。

Wang等[3]利用Illumina高通量测序和实时定量PCR(qRT-PCR)验证了高温煮沸的新鲜人参煎液中miRNA的存在，证实经高温煮沸后的人参miRNA可以保持稳定。Zhou等[4]通过Illumina测序发现在金银花汤剂中MIR2911占miRNA读数的70%以上。与其他植物miRNA或小RNA片段相比，MIR2911在金银花汤剂制备过程中可能具有更强的抗高温能力。经RNase处理后发现MIR2911基本完好无损，验证了MIR2911的高度稳定性。为进一步检验MIR2911的稳定性是否依赖于其唯一序列5′-GGCCGGGGACGGACGACUGGGA-3′，将5′-GG突变为5′-AA或将3′-GGA突变为3′-AAA，结果两个突变体对RNase没有抗性，表明MIR2911的稳定性是基于其特定的序列和较高的GC含量。邵红伟等[5]从甘草饮片的水煎剂中提取到了甘草miRNA, 在制备水煎剂的过程中，炮制过的干燥甘草饮片经过了高温处理和冷冻干燥，从中仍然能够有效地提取到miRNA，表明甘草miRNA具有非常强的稳定性，这也为中药源性miRNA经消化道不易被破坏提供了佐证。

植物miRNA在均质、哺乳动物循环甚至煮沸过程中都完整存在，有以下几个原因：(1)一些植物miRNA的3′端存在2′-O-甲基化，这种修饰能保护miRNA的稳定性；(2)miRNA的一级序列(如高G，C含量)、miRNA的结构和缺乏RNases酶切基序也增强了miRNA的稳定性；(3)miRNA蛋白辅酶因子，如高密度脂蛋白和AGO蛋白质可防止其分解；(4)植物代谢物中的草药成分不仅为miRNA创造了良好的环境，而且还具有RNases抑制作用；(5)在运输过程中，植物miRNA被包装成微囊泡或外切体，以保护它们不被降解。

植物miRNA口服经胃肠道吸收主要存在两方面争议，一方面是胃液的胃酸、胰腺和肠道菌群分泌的核酸酶和胆盐，这些因素都可能将miRNA降解而转化为单个核苷酸，另一方面是植物miRNA能否被胃肠道吸收及其可能的机制。

最近研究发现，模拟胃液的强酸环境没有显著影响植物和哺乳动物miRNA的稳定性。Zhang等[6]从小鼠肝脏中提取总RNA，pH 2.0环境下保存数小时，研究证实酸化对miRNA的产量和质量没有显著影响。大多数植物和哺乳动物miRNA在酸性条件下都能存活至少6 h，且甲基化对植物miRNA的稳定性有保护作用。首次验证了具有完整结构的核苷酸在胃肠道中对消化有抵抗力。王文娟[7]用人参汤给大鼠灌胃，经qRT-PCR检测验证大鼠血液中含有人参miRNA，并通过靶基因预测软件分析，发现人参中的部分miRNA与大鼠部分基因高度匹配。Wang等[8]发现，人类血浆中含有许多来自外源物种的RNA，包括细菌、真菌以及玉米、大米、大豆、番茄和葡萄等。因此，植物miRNA能在胃肠道不被分解并吸收运送到血液和组织中是完全有可能的。Wang等[9]研究了6种典型植物miRNA在模拟胃肠环境中的稳定性，以及Caco-2细胞对miRNA的吸收机制。研究结果表明，植物miRNA在模拟胃肠环境中可以保持稳定性，而日常饮食中食物成分的混合提高了它们对极端胃肠条件的耐受性。植物miRNA在肠道中被核酸酶降解到一定程度，但其最终浓度高于发挥生物学功能所需的浓度。2′-O-甲基化有效地保护了在肠液中的植物miRNA，并显著提高了它们的最终浓度。不同miRNA在胃肠环境中的稳定性差异很大，并与其二级结构有关。一些miRNA的分子内自折叠可以增强其在胃环境中的稳定性，3′末端的茎环结构是抵抗RNase消化的主要因素。稳定的植物miRNA可以通过网织蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用被Caco-2细胞吸收。细胞对miRNA的摄取是顺序依赖的，受细胞膜上两种典型的受体NACh和TLR9的促进。这些结果表明，一些植物miRNA在模拟的胃肠环境中是稳定的，并可以被Caco-2细胞吸收，这是它们潜在的跨界调节作用的基础。

Yang等[10-11]利用数字液滴聚合酶链反应(PCR)证实了MIR2911在小鼠体液中的存在，并阐明其生物发生与植物26S rRNA的完整性有关。Yang等[12]对MIR2911的研究表明，如果将miRNA包裹在微囊泡、外切体或脂质体等其他载体中，某些膳食microRNA的消化稳定性可能会更高。

Zhang等[6]介绍了一种循环miRNA的可能载体——微囊泡(MVS)。外源miRNA可以通过胃肠道吸收运送到血管和其他组织。MVS是几乎所有类型的细胞在正常和病理条件下都会脱落形成的小泡。它们携带原始细胞的膜表面受体或配体，选择性地与特定的靶细胞作用，并能够转运介导细胞间通讯的生物活性脂质、mRNA或蛋白质。人血浆中的MVS是由微粒、外切体和其他泡状结构组成的混合物，人血浆中的许多类型的MVS都含有miRNA。进一步研究表明，miRNA可以选择性地包装到MVS中，并主动运送到受体细胞中。在受体细胞中，外源miRNA可以调节靶基因的表达和受体细胞的功能[13]。例如，来自4种可食用植物(葡萄、葡萄柚、生姜和胡萝卜)的纳米颗粒已被证明具有抗炎特性。植物来源的外切体样颗粒会被小鼠的肠道微生物区系吸收，保护它们免受结肠炎症状的影响[14]。由此可见，循环中的miRNA是稳定和活跃的信号分子，可由细胞分泌的MVS递送，这为细胞间和细胞器间信号转导开辟了一个新的研究领域。

外切体也是运输miRNA的一种可能载体。外切体是大小为30~100 nm的微泡，它含有不同生物分子的包括核酸，如miRNA和其他ncRNA，由不同类型的细胞分泌到细胞外液中。外切体参与多种RNA的降解和加工，参与各种RNA的代谢。外切体在多细胞生物体的细胞运输和细胞间通讯中起着重要作用，这些生理稳定的外切体可以通过运送各种类型的RNA来发挥跨物种调节的作用。外切体作为载体的优点之一是它们不受免疫反应的影响，并且它们能够穿越生物屏障，包括血脑屏障。由此可见，外切体是理想的治疗载体，它们在物理和病理条件下是稳定的，并且经预先设计的外切体可以充当载体。其药代动力学取决于外切体的来源(不同的成分可能影响生物分布)、生物效应和给药途径等因素。例如，从HEK293培养上清中分离出的外切体，先转染肿瘤抑制因子miR-let-7a后注射入组织，能够到达乳腺癌组织异种移植，并以EGF受体EGFR为靶点，产生治疗效果[15]。在来自人骨髓间充质干细胞外切体的miR-143也观察到了类似的结果[16]。MiR-143在外切体中过表达，通过下调其靶标TFF3在小鼠中对前列腺癌产生抑制作用。这可以延伸到其他miRNA，如miR-134，它被发现通过富含miR-134的外切体传递时可以减少乳腺癌细胞的迁移和侵袭[17]。

同种植物miRNA经胃肠道吸收进入血液和器官后，其分布浓度有差别，且不同种类植物miRNA在血液和器官中的含量也不同。

Zhang等[6]发现MIR168a和MIR156a可以在小鼠血浆MVS、肝脏、小肠和肺中被检测到；而MIR166a只能在血清中检测到，组织中几乎检测不到。Zhou等[4]用金银花汤给小鼠灌胃，检测小鼠血浆及各脏器中MIR2911含量变化。连续灌胃3 d后，小鼠血浆中MIR2911浓度增加了3倍，肺中MIR2911浓度增加了8倍以上，肝脏中MIR2911浓度可增加到10倍，而在小鼠肠和肾脏中MIR2911浓度保持不变。MiR159是一种古老的基因，存在于大多数陆地植物中。Yu等[18]发现miR159a主要分布在小鼠肝组织中。在小鼠的荧光图像中，经腹腔注射miR159a的小鼠的胸部显示出强烈的荧光信号，而在其他组中没有观察到荧光信号，表明miR159a主要分布在小鼠的肝组织中。继续用荧光原位杂交技术分析显示，用FAM标记的miR159a在小鼠肝组织中有表达，主要定位于细胞间质和胞浆。提示miR159a可被小鼠肝细胞摄取，进而下调小鼠肝组织中GSK-3、β介导的NF-κB和β-1关键蛋白的表达水平。

因此，在检测人和动物的血浆或血清中的外源miRNA时，miRNA的选择十分重要。植物miRNA的选择要考虑的因素主要有，植物中miRNA的浓度，以及人和动物胃肠道对植物miRNA的选择性吸收程度。因为胃肠道吸收植物miRNA可能是有选择性的，在植物中含量高的miRNA不一定在血浆中处于高水平。所以在人类或动物中检测高丰度的植物miRNA很容易失败。

miRNA2911(MIR2911)[4]是金银花(HS)的非典型miRNA，从HS水煎剂中提取的MIR2911可通过靶向IE62基因直接抑制水痘-带状疱疹病毒的复制，具有潜在的治疗流感和EV71病毒感染的作用。HS水煎剂、HS水煎剂提取RNA和人工合成MIR2911均能显著抑制H1N1病毒复制，但对Pb2和NS1 MIR2911结合核苷酸序列发生改变的突变病毒株感染无明显影响。重要的是，HS水煎剂对病毒复制的抑制作用可被抗MIR2911反义寡核苷酸所消除。MIR2911在体内外对H5N1和H7N9病毒复制也有抑制作用，给予MIR2911或HS水煎剂显著降低了由H5N1感染引起的小鼠死亡率。

王文娟等[7]通过实验验证，人参miRNA能够影响INF-8、IL-10、MMP9、IL4R、MARK14、TNF-α、BCL2L1mRNA的表达，其可能影响多条免疫应答信号转导通路，进而调节多种细胞因子的表达。

邵红伟等[5]证明甘草miRNA不仅能够增强外周血单个核细胞的增殖能力，还能够增强免疫细胞的抗原递呈能力，这为解释甘草具有调节机体免疫功能的作用奠定了基础。在课题组后续实验中，何免等[19]发现甘草miRNA提高免疫细胞活性或刺激增殖方面的作用不大，对机体通过直接提高免疫系统作用也不明显。但甘草miRNA对与癌症发生、发展相关的基因，如原癌基因c-JUN/c-FOS、抑癌基因p53、调控凋亡的Bax/Bcl-2、Fas/FasL信号转导系统和转录激活因子STAT1作用效果非常明显。因此，甘草miRNA对多种细胞因子影响不大，仅有可能影响到其中某些基因的表达。

Yang等[20]发现，丹参中的Sal-miR-1和Sal-miR-3可调节OTUD7B/KLF4/NMHC IIA轴从而抑制血管重构。丹参提取物Sal-miR-1和Sal-miR-3经灌胃给药后可进入小鼠体内，并能显著抑制颈动脉结扎所致的内膜增生，还可抑制凝血酶诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移和单核细胞与VSMCs的黏附。SAL-miR-1和Sal-miR-3通过与OTUD7B 3′UTR的不同位点结合，阻断凝血酶对OTUD7B的上调作用。Sal-miR-1和Sal-miR-3下调OTUD7B可以降低KLF4蛋白的去泛素化水平，而KLF4的降低则缓解了其对NMHC IIA基因转录的抑制，从而提高了NMHC IIA的表达水平。此外，NMHC IIA的增加通过维持VSMC的收缩表型来抑制VSMC的迁移和单核细胞与VSMC的黏附。

Minutolo等[21]研究了辣木籽(MO)植物精制提取物miRNAs对机体免疫应答和抗HIV感染的作用。分析了MO p-miRs转染HIV+PBMCs的效果，发现随着细胞凋亡率的增加，细胞存活率下降，表达Fas的辅助性T细胞增多，细胞内Bcl-2蛋白表达降低。MO p-miRs具有诱导细胞凋亡(Fas和BcI2介导的凋亡)、降低淋巴细胞活性和病毒复制的能力。同时，没有检测到对健康志愿者的外周血单个核细胞产生任何影响。CD4+T细胞被MO p-miRs转染后，细胞活性显著降低，T细胞分化改变，从而使中央和效应器记忆细胞减少，的同时增加了终末效应器记忆细胞。并且p-miRs转染减少了细胞内的HIV p24蛋白和病毒DNA整合。经证实，p-miR858b的序列存在于MO p-miR池中，并预测其靶点为与HIV-Nef结合有关的VAV1蛋白。VAV1蛋白在T细胞抗原受体信号转导中起关键作用，可触发多种途径的激活。合成的p-miR858b转染HIV+PBMC后，VAV1和HIV p24蛋白的表达降低。

Kalarikkal等[22]证实在生姜中类外切体囊泡的纳米颗粒中存在靶向SARS-CoV-2的miRNA，并且它们在细胞内环境中以SARS-CoV-2基因组/转录组为靶点的可能性更高。将纳米颗粒形式的miRNA靶向SARS-CoV-2，发现这些miRNA可以选择性地在SARS-CoV-2的主要靶组织中传递。由于这些纳米颗粒可在体内蓄积到肺组织中，靶向SARS-CoV-2基因组的纳米颗粒形式的miRNA有望作为一种新冠肺炎替代治疗手段。生姜衍生的类外切体纳米颗粒还可以预防肝脏相关疾病的发展，如酒精诱导的损伤[23]，并通过减弱细胞因子和促进肠道细胞增殖来预防炎症性肠病[24]。

Shen等[25]通过实验证实，通过鼻腔给药，黄芪来源的miR-396在哮喘小鼠的脾脏、外周血和肺组织中的表达水平是内参基因的10倍左右。经20 μg miR-396模拟物连续7次治疗后小鼠IL-5、IL-13细胞因子水平显著降低，且miR-396下调了Th2细胞主要转录因子GATA-3的表达。

天麻(GE)是一种珍贵的中草药，具有抗惊厥、神经保护、抗炎和免疫调节作用。Xia等[26]通过Illumina高通量测序，在GE中发现了5 718个miRNA，其中52个是新发现的GE miRNA。功能预测表明，Gas-mi R01和Gas-mi R02可能干扰3个关键基因：A20、TNF-α和IκBα。将Gas-mi R01和Gas-mi R02模拟物转染293T细胞，可显著抑制NF-κB-driven基因的重要反馈调节因子A20的表达。此外，给小鼠用天麻煎煮液灌胃后，可以在小鼠的血清、肝、脑、肾、脾中检测到高水平的Gas-mi R01和Gas-mi R02，而A20的表达降低[27-28]。这些结果提示GE miRNA是GE中的一组活性成分，可能与天麻的抗炎和免疫调节作用有关。

ABA miRNA 9497是从颠茄中分离得到的，与智人miRNA-378有很高的同源性。Avsar等[28]首次证明ABA miRNA 9497和miRNA-378都可以通过与人中枢神经系统富含ZNF-691基因的3′-UTR结合而下调该基因的mRNA表达。他们推测颠茄的神经毒性作用可能部分源于aba-miRNA-9497对ZNF-691的调节作用。由于ZNF-691参与了炎症等多种神经病理过程，因此利用aba miRNA 9497靶向ZNF-691作为炎症在多种疾病中的重要作用将引起人们的极大兴趣。

植物miRNA能否口服进入体内并发挥作用仍存在分歧：支持者认为在动物体内检测到的植物miRNA是真实存在于动物体内的植物miRNA；而否认者认为这些检测到的植物miRNA是由样本污染或者仪器误差造成的假阳性结果。此类实验的一般思路为，为了验证外源miRNA能否进入体内并发挥作用，设计动物喂养实验并设置对照组(通常是给某种动物喂食包含不同含量植物miRNA的食物)。然后测量动物体液或组织中的植物miRNA含量，再根据实验组和对照组在植物miRNA种类和含量上的差别，最后得出支持或否认的结论。这就显露了不同研究团队实验结果之间矛盾的原因：其一，不同动物物种、不同植物性食物以及不同组织器官、体液的特异性；其二，样本种类单一、数量有限。从而难以在统计层面将其与污染物及仪器误差区分开。

尽管有大量研究证明外源miRNA可作用于人体，但这些miRNA的生物利用度仍然存在争议。原因包括实验数据可重复性低，序列分析中存在技术错误，或是研究设计本身不合理。Dickinson等[29]首先驳斥了植物miRNA摄取和跨物种调节的概念。他们给小鼠喂食对照食物、添加41%大米的食物、添加75%大米的食物。然而，用血浆和肝组织的总RNA进行miRNA测序时，水稻来源的miR-168a在1 000多万个读数中显示不到10个读数。同样，健康运动员食用了含有高水平miR-156a、miR-159a和miR169a的水果后，血清中也没检测出这些miRNA。在另一项研究中，Huang等[30]用从玉米粉RNA中分离出的miRNA喂养小鼠，两周后没有在小鼠体内检测到玉米miRNA，他们推测大多数miRNA在消化过程中被广泛降解。Witwer等[31]给猪尾猕猴喂食了以植物为基础富含miRNA的物质，后用qRT-PCR检测其血浆，没有检测到miR160、miR156、miR166、miR167、miR168和miR172。Snow等[32]让健康受试者摄入含有miRNA的水果后，没有在血浆中检测到miR156a，miR159a和miR169a。这些不一致可能源于细胞外miRNA研究领域中常见的技术问题，包括miRNA浓度低，缺乏标准的RNA提取方法，以及缺乏适当的内部控制。分析和引物设计错误也影响了几个已发表的关于外源miRNA在人体循环中的生物利用度的文章。在Pastrello等[33]发表的文章中，作者最初在大量食用西兰花的健康人血清样本中检测到了植物miRNA，但后来以引物设计策略错误而导致虚假扩增为由撤回了这篇文章。

此外，几个公开可用的NGS数据集通常被植物来源的miRNA污染。通过分析来自人类组织和血清的824个测序数据集，发现其中存在非人类的miRNA序列，包括植物来源的miRNA，尽管丰度较低。此外，Kang等[34]发现外源miRNA的存在和丰度，与miRNA直接摄入的器官(如肝脏)和非直接摄入的器官(如脑脊液)之间没有明显的相关性。他们分析了800多个体液和组织样本，得出结论，在人体内检测到植物miRNA是由于交叉污染，甚至是人工制品。Heintz-Buschart等[35]验证，这些miRNA污染的来源，其中之一可能是因为使用了商业miRNA纯化试剂盒，从而在萃取柱中引入了外源miRNA。用不含核酸酶的水作为输入样本，通过这些柱子进行RNA分离，可得到几个小RNA。在公共数据集中可以查找到这些受污染的小RNA序列，虽然这些小RNA的含量较低。为避免这种污染，在分离RNA之前，用次氯酸钠处理柱子，然后用无核酸酶的水清洗，可以显著减少这些小RNA种群的污染。

以前的研究已经解释了植物miRNA的稳定性。但Xie等[2]在研究中发现，甲基化的hsa-let-7a不能在酶环境中存活(例如，RNase处理和各种槲寄生提取物)，这表明植物miRNA的甲基化可能不是在草药制备过程中保持它们稳定的关键因素。此外，合成的miRNA在与槲寄生制剂一起加工时迅速降解，表明提取物中的次生代谢物不能有效地保护miRNA不被降解。除此之外，Denzler等[36]和Howard等[37]独立发表的研究论文指出，缺乏证据表明植物miRNA可以进入哺乳动物循环系统，认为没有阐明miRNA调节动物体内营养代谢过程的途径。

对于miRNA的矛盾实验结果，需要仔细考虑实验设计及操作过程中各个环节的关键问题，如选择合适的miRNA、正确的miRNA提取方法、合理的实验设计、最小化测序偏差、准确的归一化等。miRNA丰度并不是植物中miRNA摄取的唯一决定因素，某些富含在植物中的miRNA可能仍然在体内无法检测到。由于植物miRNA可能存在选择性吸收，随机选择一种或两种植物miRNA来测量摄取量具有很高的风险。究竟什么样的序列排列或核苷酸组成是可获得的？哪种类型的miRNA修饰可以产生高摄取效率？miRNA在体内的代谢机制是怎样的？这些问题在今后仍有待解决。常见的核酸定量技术，如实时PCR、微阵列和深度测序，还不足以识别miRNA的转移。检测特定miRNA的新工具正在被探索。Croci等[38]首次证明了放射性标记的anti-miR PNA探针可以用于细胞中的分子成像，从而为miRNA表达的体内成像提供了数据和提示。

植物药miRNA可以经口服吸收并发挥跨界调控作用，让植物药miRNA作为活性成分发挥作用成为可能，拓宽了中药作用机制在分子层面的研究，并为临床药物治疗提供了理论依据和实验基础。但现有相关研究中仍存在一些不足，应针对这些不足进行完善，改善实验设计和纠正技术错误，以解决中药miRNA口服吸收并发挥跨界调控作用研究中的问题与不足。