研究miRNA与靶基因互作的小伙伴大多都会用到双荧光素酶报告基因检测试剂盒，那么在第一次用双荧光素酶报告基因检测试剂盒研究miRNA时，应该构建哪些载体？转染时需要设置哪些组别？得到数据后又该如何分析呢？今天，小V就来给大家分享下如何用双荧光素酶报告基因研究miRNA与靶基因互作。

什么是双荧光素酶报告基因？

双荧光素酶报告基因通常指的是萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因。

在双荧光素酶报告基因载体中，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶基因都有各自的启动子、终止位点，二者独立表达互不干扰。

萤火虫荧光素酶基因表达萤火虫荧光素酶，可以催化底物萤光素产生荧光信号。

海肾荧光素酶基因表达海肾荧光素酶，可以催化底物腔肠素产生荧光信号。

根据研究目的对双荧光素酶报告基因载体进行改造，将重组表达载体和其他质粒或物质共转染至细胞中，培养一段时间后裂解细胞样品，先以萤光素为底物检测萤火虫荧光素酶的表达，再以腔肠素为底物检测海肾荧光素酶的表达，同时抑制萤火虫荧光素酶的活性。海肾荧光素酶作为矫正转染效率的内参，消除孔间细胞数量和转染效率的差异。萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的荧光强度比值可以作为报告基因活性的检测方法。

什么是miRNA？

MicroRNA（miRNA）是植物和动物细胞中自然产生的18-25个核苷酸的小型非编码单链RNA，miRNA是由长约75 nt的茎环结构前体RNA被Dicer RNase酶切而成。这些miRNA通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA的3’ UTR，根据互补的程度指导沉默复合体降解靶基因或阻碍mRNA的翻译。

双荧光素酶报告基因研究miRNA与靶基因互作的原理？

miRNA主要通过作用于靶基因的3’ UTR起作用，因此可以将目的基因的3’ UTR区域构建到载体报告基因萤火虫荧光素酶的后面，通过与miRNA共转染后，检测报告基因表达的变化来反映miRNA对目的基因的抑制作用。

实验设计

1、靶基因预测

应用相关生物信息学软件预测miRNA靶向作用于靶基因的3’UTR区。

2、提取基因组DNA

3、引物设计

4、扩增目的片段（包含以下2种片段）

5、载体构建

备注：pmirGLO载体包含萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因

6、其他材料

miRNA mimics、miRNA inhibitors 及 miRNA NC 可通过化学方法来合成

7、转染组别设置如下

转染的具体操作步骤可参考转染试剂说明书

8、双荧光素酶报告基因检测

检测时，每个样本建议做 3 个技术重复。具体操作步骤参考双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书。

数据分析

1、去除背景

空白对照中没有转质粒和miRNA，只有细胞样本和转染试剂，理想条件下应该是不会检测出数值的。但实际上，可能会检测出极低的数值，这个数值就是背景值。得到数据后，首先用每个样品的萤火虫荧光素酶数值减去空白对照中的萤火虫荧光素酶数值，将每个样品的海肾荧光素酶数值减去空白对照中的海肾荧光素酶数值。

2、数据归一化

将同一个样品的去除背景后的萤火虫荧光素酶数值（F）除以去除背景后的海肾荧光素酶数值（R）。

3、技术重复取平均值

同一个生物学重复下的技术重复，对归一化后的数据取其平均值（如下表）。

4、生物学重复取平均值

对于同一组下的生物学重复，对归一化后的平均值再次取平均值。

5、计算倍数变化

分别以只转质粒的1组/2组/3组为对照，相对应的每个实验组（4组-12组）依次除以对照（如下图）。

如4组的再次平均值除以1组的再次平均值。

作图结果如下图示例，相比于携带野生型质粒和miRNA NC的阴性对照组，在携带野生型质粒和miRNA mimic（miRNA模拟物，模拟miRNA过表达）的实验组中相对荧光素酶活性显著下降；在携带突变型质粒（miRNA结合靶基因3’ UTR的结合位点已被突变）和miRNA mimic的实验组中相对荧光素酶活性无显著变化。

在携带野生型质粒和miRNA inhibitor的实验组中相对荧光素酶活性显著上调，而在携带突变型质粒和miRNA inhibitor的实验组中则无显著变化。

说明miRNA能够结合靶基因3’ UTR抑制基因表达。