以PD-1/PD-L1抑制剂代表的免疫检查点抑制剂（ICIs）治疗，已成为转移性非小细胞肺癌（mNSCLC）患者的标准治疗方案。然而，在mNSCLC的二线或多线治疗中，单独使用PD-1抑制剂治疗仅有20%的患者显示出临床获益[1, 2]。大多数患者对ICIs治疗存在固有的抵抗。

使用铂类为主的双化疗药联合ICIs治疗可以一定程度上解决其耐药的问题[3, 4]。这与铂类化疗药能诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡（ICD），并促进免疫细胞招募从而增强对ICIs的反应密切相关。

然而，最近的临床试验表明，大多数患者未能从培美曲塞联合顺铂（PEM/CDDP）与PD-L1抑制剂治疗中获得持久的益处[5]。这背后的原因还鲜为人知。

近期，来自法国勃艮第大学的Francois Ghiringhelli和Emeric Limagne研究团队在Cancer Cell杂志上发表了重要研究成果[6]。

他们发现培美曲塞联合顺铂虽然可以诱导肿瘤细胞发生ICD，但却不能增效ICIs治疗。这背后的原因竟然是培美曲塞联合顺铂不能诱导肿瘤细胞表达CXCL10，以及不能促进CD8+T细胞向肿瘤部位浸润。

好消息是，他们发现联合MEK抑制剂（MEKi）治疗后，可促进癌细胞分泌CXCL10，招募更多的CD8+T细胞进入肿瘤，从而增加ICIs的抗肿瘤疗效。

▲论文首页截图

接下来我们就一起来看看Ghiringhelli团队是如何开展这个研究的。

众所周知，mNSCLC常规标准化双药方案是由PEM、吉西他滨（GEM）或多西他赛（DOC）分别联合铂类化疗药组成。为了检测这些双药方案的免疫原性，研究人员选择对PD-L1抑制剂耐药的LLC1小鼠肺癌细胞株和氨基甲酸乙酯（一种致癌有机物）诱导的肺癌细胞株为模型进行了研究。

他们先检测了上述四种化疗药处理后LLC1细胞ICD标志物的表达情况，结果发现CDDP本身不能诱导ICD相关标志物的产生，而PEM处理后则能检测出9种，表明PEM能诱导ICD。

随后的联合用药研究发现，只有培美曲塞联合顺铂能够显著抑制肿瘤增长。但培美曲塞联合顺铂+ICIs后，与培美曲塞联合顺铂抗肿瘤效果无显著性差异。也就是说，培美曲塞联合顺铂虽然能诱导肿瘤细胞发生ICD，但与ICIs联用后并无协同抗肿瘤作用。这就有点儿奇怪了。

事出反常必有妖。

Ghiringhelli团队还随后发现，原来培美曲塞联合顺铂不能诱导肿瘤细胞表达趋化因子CXCL10，因此就不能促进CD8+T细胞的进入肿瘤。

有了这一发现，解决问题的思路似乎就浮出水面了。

Ghiringhelli团队认为，在培美曲塞联合顺铂的基础上再增加一种能促进肿瘤细胞分泌CXCL10的药物，或许就能打破肿瘤对培美曲塞联合顺铂+ICI耐药的问题。

▲A 相应药物处理后的 LLC1 细胞ICD标志物表达情况；D Rechallenge实验检测相应化疗药的免疫特性，肿瘤存在时间曲线示培美曲塞联合顺铂组缓解了肿瘤的生长，疗效与DXR组相似；E 在荷瘤小鼠模型上用相应药物治疗后的肿瘤生长曲线示培美曲塞联合顺铂与培美曲塞联合顺铂+PD-L1治疗组肿瘤生长无显著性差异。

Ghiringhelli团队将研究重点聚集在了29种已经用于临床或正在开展临床研究的激酶抑制剂上，希望能从中筛选到合适的药物。

他们发现，靶向MEK1/2和ERK1/2的药物和特定的KRAS G12C抑制剂，能促进培美曲塞联合顺铂处理后的LLC1细胞表达CXCL10。

在接下来的实验中，Ghiringhelli团队选择了诱导CXCL10表达能力最强的MEK1/2抑制剂（MEKi）曲美替尼开展进一步的研究。

在MEKi剂量依赖实验中，Ghiringhelli和他的同事发现，单独使用MEKi对LLC1细胞CXCL10 mRNA的表达没有影响，但MEKi能促进培美曲塞联合顺铂处理后的LLC1细胞CXCL10 mRNA的表达和蛋白的分泌，且呈剂量依赖性。

体内抗肿瘤实验也验证了培美曲塞联合顺铂与MEKi联用，可以恢复癌细胞分泌CXCL10和促进CXCL10依赖的CD8+T细胞的募集，从而促进了培美曲塞联合顺铂的抗肿瘤作用，显著延缓了肿瘤的生长并提高了小鼠的存活率。

▲A 不同激酶抑制剂处理后 LLC1 的 CXCL10 表达情况；B、C LLC1的CXCL10表达随曲美替尼浓度的增加而增加

为了证明使用MEKi能够恢复化疗与免疫抑制治疗的抗肿瘤效果，Ghiringhelli团队又构建了LLC1小鼠皮下瘤模型，及氨基甲酸乙酯诱导的肺癌模型。对比培美曲塞+顺铂+PD-L1抑制剂组合与MEKi+培美曲塞+顺铂+PD-L1抑制剂组合的治疗效果，结果发现后者的肿瘤增长速度显著低于前者，且明显延长小鼠的生存期。也就是说，使用MEKi能够恢复化疗联合免疫治疗的抗肿瘤效果。

▲A 相应药物治疗后LLC1 小鼠皮下瘤模型肿瘤增长曲线及生存曲线；B 相应药物治疗后LLC1 小鼠原位瘤模型肺部肿瘤灶统计图

为了进一步探索其他药物是否有类似的作用，Ghiringhelli团队进一步检测了16种常用的化疗药物（包括铂类、抗代谢类、烷化剂、微管蛋白靶向剂、拓扑异构酶I/II抑制剂等）处理后，LLC1细胞中CXCL10的表达情况。

结果他们发现，拓扑异构酶I/II抑制剂（DXR、依托泊苷等）和抗代谢药物（PEM、GEM等）可以增加LLC1细胞中CXCL10基因的表达，而铂类、烷化剂及微管蛋白类则不能，且MEKi能够促进DXR与抗代谢药物联用后LLC1细胞中CXCL10的表达。因此，MEKi能在体外增加了GEM/CDDP处理后的肺癌细胞中CXCL10的表达，而不能增加DOC/CDDP双药处理的肺癌细胞中CXCL10的表达。

为了了解MEKi克服化疗联合免疫抑制剂组合的普适性，Ghiringhelli团队又在结肠癌、三阴性乳腺癌细胞上，也验证了使用MEKi能够增强化疗药与PD-L1抑制剂治疗的抗肿瘤疗效。这表明MEKi能够逆转不同肿瘤的化疗与免疫治疗联用带来的耐药问题。

K 在 4T1 皮下瘤模型中，MEKi 能促进 DRX/PD-L1 抑制剂的抗肿瘤疗效；L 在 CT26 皮下瘤模型中MEKi 能促进FTP/TPI/OxPt/PD-L1 抑制剂的抗肿瘤疗效

为了寻找MEKi逆转化疗联合免疫治疗的耐药机制，Ghiringhelli团队通过流式细胞分选技术，从相应药物处理后的小鼠肿瘤中分选出免疫浸润淋巴细胞（TILs）和肿瘤细胞，并分析其CXCL10基因的表达情况，发现在TILs与肿瘤细胞中，CDDP/PEM/MEKi治疗组的CXCL10表达量最高。

在对CDDP/PEM和CDDP/PEM/MEKi处理过的LLC1细胞进行mRNA测序后，Ghiringhelli团队又进行了基因集富集分析（GSEA）。他们发现，PEM/CDDP/MEKi作用后，参与自噬的基因通路显著上调。

通过WB实验发现，MEKi或PEM/CDDP促进了自噬相关通路蛋白LC3的脂化，以及ULK1的磷酸化（Ser555），而MEKi和PEM/CDDP联合治疗进一步增强了上述现象，表明两者联用自噬通量增加。抑制自噬早期阶段的Vps34或ULK1抑制剂的使用，会减弱PEM/CDDP/MEKi诱导的CXCL10的表达。不过，晚期自噬抑制剂巴佛洛霉素A1则增加了Cxcl10的表达。

考虑到自噬相关蛋白5（ATG5）是参与自噬泡中吞噬细胞膜延伸的关键蛋白，Ghiringhelli团队通过构建ATG5基因敲除的LLC1细胞，发现PEM/CDDP/MEKi处理后，LLC1细胞CXCL10的mRNA水平和蛋白均水平均降低。体内实验也发现，ATG5基因敲除的LLC1细胞构建的小鼠模型，在PEM/CDDP/MEKi处理后CXCL10 mRNA的水平和蛋白的表达均较低，不能招募募更多的CD8+ T细胞进入肿瘤。

上述结果表明早期自噬参与CXCL10的产生。

▲A LLC1荷瘤小鼠接受相应药物治疗后CXCL10的相对基因表达；B相应药物处理后的LLC1细胞差异表达基因集富集分析（GSEA）；C 相应药物处理后自噬相关通路蛋白的表达情况；D、E Atg5+/+和Atg5 -/- LLC1细胞在相应药物处理后 CXCL10 的qPCR 分析和 ELISA分析；F Atg5+/+和Atg5 -/- LLC1荷瘤小鼠免疫相关基因的相对表达；G Atg5+/+和Atg5 -/- LLC1荷瘤小鼠肿瘤的CD8免疫组化分析

为了进一步探索早期自噬如何干预CXCL10的产生，Ghiringhelli团队通过相关实验发现，MEKi以剂量和时间依赖的方式增强PEM/CDDP诱导的线粒体自噬。而使用限制早期自噬的Vps34抑制剂就会减少PEM/CDDP/MEKi治疗后的线粒体自噬。

有趣的是，当LLC1细胞呈现高水平线粒体自噬时，会转录更多的CXCL10 mRNA，这表明线粒体自噬与CXCL10表达密切相关。接下来研究者们发现，在PEM/CDDP/MEKi治疗过程中，mtDNA激活了癌细胞中的TLR9，并促进了CXCL10的表达，从而导致CXCL10依赖的CD8+T细胞募集。因此，TLR9在肿瘤细胞中的表达，对PEM/CDDP/MEKi联合PD-L1抑制剂治疗的疗效至关重要。

最后，Ghiringhelli团队在一系列不同基因突变的人类肺癌细胞中证实，PEM/CDDP/MEKi的确能恢复CXCL10的表达。他们还对晚期NSCLC患者的回顾性队列研究的血浆因子进行多重分析，证实了多功能自噬受体蛋白（OPTN）、CXCL10、TLR9与ICIs治疗获益呈正相关。这进一步阐明干预TLR9/CXCL10/OPTN通路能增加ICIs治疗的疗效。

▲化疗和MEKi同时治疗可通过TLR9促进线粒体自噬。TLR9信号导致癌细胞中CXCL10的表达和CD8+T细胞向肿瘤的募集，并提高PD-L1抑制剂的疗效

总的来说，这个研究为解决化疗联合免疫治疗耐药问题，提供了一种新治疗思路。

参考文献

[1] R.S. Herbst, P. Baas, D.W. Kim, E. Felip, J.L. Pérez-Gracia, J.Y. Han, J. Molina, J.H. Kim, C.D. Arvis, M.J. Ahn, M. Majem, M.J. Fidler, G. de Castro, Jr., M. Garrido, G.M. Lubiniecki, Y. Shentu, E. Im, M. Dolled-Filhart, E.B. Garon, Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial, Lancet, 387 (2016) 1540-1550.

[2] H. Borghaei, L. Paz-Ares, L. Horn, D.R. Spigel, M. Steins, N.E. Ready, L.Q. Chow, E.E. Vokes, E. Felip, E. Holgado, F. Barlesi, M. Kohlhäufl, O. Arrieta, M.A. Burgio, J. Fayette, H. Lena, E. Poddubskaya, D.E. Gerber, S.N. Gettinger, C.M. Rudin, N. Rizvi, L. Crinò, G.R. Blumenschein, S.J. Antonia, C. Dorange, C.T. Harbison, F. Graf Finckenstein, J.R. Brahmer, Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non–Small-Cell Lung Cancer, New England Journal of Medicine, 373 (2015) 1627-1639.

[3] L. Gandhi, D. Rodríguez-Abreu, S. Gadgeel, E. Esteban, E. Felip, F. De Angelis, M. Domine, P. Clingan, M.J. Hochmair, S.F. Powell, S.Y.-S. Cheng, H.G. Bischoff, N. Peled, F. Grossi, R.R. Jennens, M. Reck, R. Hui, E.B. Garon, M. Boyer, B. Rubio-Viqueira, S. Novello, T. Kurata, J.E. Gray, J. Vida, Z. Wei, J. Yang, H. Raftopoulos, M.C. Pietanza, M.C. Garassino, Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non–Small-Cell Lung Cancer, New England Journal of Medicine, 378 (2018) 2078-2092.

[4] C.M. Conway, J. Arciuli, J.A.G. Lum, M.T. Ullman, Seeing problems that may not exist: A reply to West et al.'s (2018) questioning of the procedural deficit hypothesis, Dev Sci, 22 (2019) e12814-e12814.

[5] A.M. Frederickson, S. Arndorfer, I. Zhang, M. Lorenzi, R. Insinga, A. Arunachalam, T.A. Burke, G.R. Simon, Pembrolizumab plus chemotherapy for first-line treatment of metastatic nonsquamous non-small-cell lung cancer: a network meta-analysis, Immunotherapy, 11 (2019) 407-428.

[6] E. Limagne, L. Nuttin, M. Thibaudin, E. Jacquin, R. Aucagne, M. Bon, S. Revy, R. Barnestein, E. Ballot, C. Truntzer, V. Derangère, J.D. Fumet, C. Latour, C. Rébé, P.S. Bellaye, C.G. Kaderbhaï, A. Spill, B. Collin, M.B. Callanan, A. Lagrange, L. Favier, B. Coudert, L. Arnould, S. Ladoire, B. Routy, P. Joubert, F. Ghiringhelli, MEK inhibition overcomes chemoimmunotherapy resistance by inducing CXCL10 in cancer cells, Cancer Cell, (2022).

责任编辑丨BioTalker