巫蒙 王梅

肿瘤是机体遗传和环境致癌因素以协同序贯的方式使局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，包括多个癌基因的活化与抑癌基因的二次失活，是正常细胞不断增生转化所形成的新生物。肿瘤的发生是一个长期多阶段多基因改变累积的过程，具有基因控制和多因素调节的复杂性[1]。

在肿瘤治疗中，手术治疗、放疗、化疗是最传统的3种治疗方案，其中化疗占据着不可替代的重要地位。有些肿瘤在经历了最初有效化疗后，仍难免复发，这其中一个很重要的原因就是肿瘤细胞对化疗药物产生了多药耐药性。合理的联合化疗虽能最大限度发挥细胞毒作用，但都可因多药耐药(Multidrug Resistance,MDR)的出现而宣告失败。MDR是指肿瘤细胞接触一种抗肿瘤药物后，产生对多种结构不同的、作用机制各异的其他抗肿瘤药的耐药性。MDR是目前肿瘤细胞免受化疗药物攻击的最重要的细胞防御机制，涉及临床常用的多种抗肿瘤药物，是肿瘤成功化疗最严重的障碍之一，白血病、多发性骨髓瘤、食管癌、乳癌、小细胞肺癌、肝癌、结肠癌、肾癌、子宫癌、脑瘤、纤维肉瘤、神经母细胞瘤以及宫颈癌等面临严重的MDR问题。因此研究MDR的发生机制并找到MDR逆转方向，可以提高肿瘤化疗效果。近年来，随着对肿瘤药物治疗的进一步研究，探索肿瘤细胞多药耐药的机理并加以有效逆转，已成为肿瘤研究领域急待解决的问题。

MDR现象是Biedler[2]在1970年首次发现，之后国内外对MDR进行了广泛而深入实验与临床研究，目前研究肿瘤耐药机制主要是从MDR基因表达的产物入手，探讨此类产物引起的耐药机制。目前认为可能有以下几种原因。

MDR基因在人类有二种：MDR1和MDR2，其中MDR1与肿瘤的多药耐药有关，MDR2的功能不清楚，但MDR1和MDR2基因序列具有较高的同源性。人类MDR1基因位于第7号染色体长臂上，含有28个外显子，内含子与外显子交界符合经典的APG配对，全长为4.5kb，含有一个开放读框，编码1280个氨基酸多肽，经糖基化后形成170kU的P-gp。它属于ATP结合盒转运蛋白超家族成员之一，由两个同源部分组成，每个部分都包含6个疏水跨膜区和1个具有高度保守ATP结合位点的亲水区，亲水区可能含有2个核苷酸结合位点，而疏水区则含有多个与MDR有关的药物结合位点[3]。P-gp还具有能量依赖性“药泵”功能，其能将细胞内带阳性电荷的亲脂类化疗药物逆浓度泵至细胞外，使得细胞内化疗药物达不到有效作用浓度而产生耐药性。这种由P-gp介导的多药耐药称为典型多药耐药。

何杨[4]等研究发现P-gp的过度表达可能参与了乳腺癌的原发耐药机制。MDR1基因及蛋白表达产物P-gp高表达临床上与肿瘤化疗耐药复发和预后密切相关。现在认为P-gp作用机制是[5]：当抗癌药进入胞浆膜，被识别并外排，当具有疏水结构域的抗癌药弥散通过胞浆膜时，遇到两侧扩散来的多药耐药运载体，运载体利用两个ATP结合位点上的能量将药物泵出细胞外，胞膜胞浆中产生的疏水代谢产物作为转运体的潜存底物，且这种通路不止一条。化疗及其他药物单一的长期治疗激活了P-gp的功能，使得药物在细胞内积蓄减少，从而产生了肿瘤的多药耐药。

DNA拓扑异构酶(Topo)是在DNA复制、转录和染色体分离中起重要作用的核酶。许多化疗药物以TopoⅡ为靶点，干扰基因正常的断裂重接过程，导致基因破坏和靶细胞的死亡。肿瘤细胞内TopoⅡ表达水平下降，使肿瘤对抗肿瘤药物敏感性下降，可引起肿瘤细胞的耐药。在对93例SCLC化疗患者进行的Ⅲ期临床研究中[6]，研究者用免疫组织化学法对支气管镜活检组织中拓扑异构酶－Ⅱ的表达情况进行了分析，发现拓扑异构酶-Ⅱ的表达水平与化疗有效率有关，高表达的肺癌患者生存率明显高于低度或中度表达者。李占文[7]等采用免疫组化法对78例术前未行化疗患者的乳腺癌组织切片中TopoⅡ的表达进行分析，发现TopoⅡ的阳性表达率为73.1%，据此认为TopoⅡ的表达与乳腺癌MDR有一定关系。乳腺癌组织的原发MDR与TopoⅡ的表达有关,化疗前对它们进行检测可为化疗药物的选择及预后判断提供参考依据。

肿瘤细胞对凋亡的耐受是MDR的重要机制之一，近来研究表明多数细胞毒制剂通过诱导凋亡来杀伤细胞治疗肿瘤，研究发现细胞凋亡相关基因如bcl-2，突变P53等的过度表达与肿瘤的发生有关，细胞凋亡相关基因为耐药的靶分子，可与其他途径共同介导[8]。

Cole等[9]在研究小细胞肺癌耐药株H69AR(对阿霉素耐药)过程中发现MRP基因。近年来Kruh等[10]从白血病耐药细胞株HL60R中所获得的MRP2cDNA装入到人pCEV27噬菌体质粒嵌合体中，再转染NIHP3T3细胞，用MTT法检测发现阿霉素50%抑制浓度IC50在转染后的细胞较转染前升高2.7倍，对与阿霉素结构不同的长春碱、足叶乙甙也产生耐药，可知MRP直接参与MDR。杨波[11]等通过检测MRP蛋白的表达, 发现SACC/DDP细胞的细胞浆中以及细胞膜上MRP蛋白的表达率很高可能是涎腺腺样囊性癌细胞产生多药耐药的机制所在。目前研究认为MRP耐药与mdr-1的基因3扩增、mRNA和p-170膜蛋白（p-gp）表达升高有关，MRP可识别化疗药物，并与之形成耦合物，导致细胞内药物浓度降低或分布改变，而发生肿瘤耐药。

PKC是一种钙磷脂依赖性蛋白激酶，参与细胞内生物信息传递，表达与P-gp的功能有密切关系。具有MDR表型的肿瘤细胞中， PKC可通过促进P-gp的磷酸化增强其药泵功能，导致MDR的产生。最近研究发现PKC抑制剂可以抑制胃癌细胞中P-gp的表达和逆转其耐药性，促进肿瘤细胞的凋亡，可能对MDR1的表达有调节作用[12]。

caveolin是细胞膜呈欧米伽（Ω）样内陷的微结构，直径约为50～100nm。caveolin可以从细胞膜上分离出来，形成细胞质内的膜小体。caveolin是特化的细胞膜微结构域，它由其特异性的被覆蛋白caveolin及多种脂类分子和膜蛋白组成，在细胞外分子的内化、信号的跨膜转导和胆固醇的转运过程中起着重要的作用。新近的研究表明，caveolin及其某些组成成分在肿瘤多药耐药细胞中表达上调，并有可能参与了肿瘤细胞多药耐药性的形成。研究显示，长春碱诱导耐药的卵巢癌细胞skvlb1和紫杉醇诱导耐药的肺癌细胞 A549-T24显著上调了caveolin-1的表达[13]。

肿瘤细胞对抗癌药物产生多药耐药性，已经成为肿瘤治疗失败的主要原因之一。目前对逆转剂的认识不是要不要的问题，而是处于什么肿瘤耐何种药物，用什么逆转剂和怎么用？临床根据耐药机制，注意3个方面：肿瘤类型、何种药物耐受、毒副反应。

现阶段主要针对如何抑制mdr-1的编码产物P-gp。P-gp抑制剂作为逆转的一种方法，已经被广泛深入的研究。肿瘤细胞过量表达P-gp导致多药耐药是目前肿瘤化疗的一大障碍，使用多药耐药逆转剂与抗癌药物联合化疗是克服临床肿瘤MDR的重要方法。同时，人们也在开展针对其他机制来逆转肿瘤的多药耐药性。

具有抑制药物转运泵功能，MDR逆转剂的应用无疑是解决MDR的一种常用方法。

2.1.1 P-gp抑制剂

P-gp抑制剂作为逆转的一种方法，已经被广泛深入的研究了二十多年，根据它们的特点，可将其分为三代[14]。研究者们运用结构－活性关系和组合化学的方法，针对特异性机制，开发出了在低于抑制P-gp的浓度下，具有逆转活性的逆转剂。

2.1.2 环孢霉素A及其类似物

无免疫抑制作用的环孢霉素A衍生物西罗莫司(SDZPSC833)在体内外能够逆转MDR1基因的表达，阻止MDR克隆的形成，国外已将该药用于难治性白血病和实体瘤的临床研究[15]。赵春亭[16]在国内首先用环孢霉素A临床逆转一例难治性急性髓细胞白血病患者的多药耐药，使患者获完全缓解，MDR细胞消失，说明MDR逆转成功。初步研究发现环孢霉素A可提高该患者白血病细胞内柔红霉素的浓度，继而将CsA与人白血病MDR细胞系K_(562)／AO2共同培养，细胞内药物浓度的动态观察提示，K_(562)／AO2细胞与CsA共同培养后，可使DNR进入增多、排出减少，DNR的细胞内浓度提高，K_(562)／AO2细胞对DNR的敏感性提高了3.2倍。环孢霉素类药物逆转耐药的机理不完全清楚，比较公认的是P170-MDR学说：多数学者认为环孢霉素类药物是一种高度亲脂类药物，它与抗癌药竟争P170的结合位点，从而抑制其跨膜泵作用，使抗癌药的外排降低，提高细胞内抗癌药浓度而逆转耐药。

2.1.3 蛋白激酶抑制剂

蛋白激酶(PKC)可以改变药物在MDR细胞中的蓄积，在一些MDR的肿瘤细胞PKC的活性增加，推测抑制PKC的活性可以对抗MDR的发生。

近年来，国内外开始将反义技术应用于肿瘤耐药性逆转的研究。根据碱基互补原理，设计出能特异地同相应靶基因结合的RNA或DNA，影响靶基因的转录和翻译，以达到特异抑制靶基因表达的基因调控技术，包括反义RNA(antisenseRNA)技术，反义DNA(antisenseDNA)技术，又称核酶(ribozyme)技术。

报道比较多的技术有MDRl基因的反义寡聚脱氧核糖核酸(AOD)，MDRl基因的反义RNA，切割MDRl mRNA的核酶外源性基因植入等技术。近几年，siRNA介导的基因干扰技术又为多药耐药基因治疗研究提供了一个全新的技术平台。siRNA可以通过特异性抑制MDR1编码的Mrna，使得P-gp的表达水平下调，从而达到耐药逆转的效果[17]。朴瑛等[18]构建ZNRD1基因的小干扰RNA载体并将其转导入HL-60/VCR细胞，研究发现小干扰RNA真核表达载体能在一定程度上逆转白血病细胞的耐药性。彭智等[19]对具有典型多药耐药特征的慢性髓样白血病急变细胞系细胞进行研究并设计了3条siRNA，研究结果表明3条siRNA都有不同程度的逆转多药耐药的作用。上述结果肯定了特异性siRNA能够有效抑制MDR-1编码的糖蛋白的表达，提示siRNA有望成为逆转耐药的有效手段。根据肿瘤细胞多药耐药的机制,还可针对其他许多耐药途径设计siRNA,但仍在研究和论证之中。

肿瘤坏死因子-α具多种生物学效应，能直接抑制或杀灭多种肿瘤细胞，并能通过抑制mdr-1基因的机制逆转MDR，但其具有的严重广泛的毒性作用大大限制了它的临床应用[20]。郭伟剑[21]采用基因治疗的方法，将外源性Tnf-α基因导入肿瘤细胞，使肿瘤局部高浓度持续表达外源性Tnf-α基因，局部发挥其生物学效应，则可解决这一问题，其采用逆转录病毒介导Tnf-α基因转染耐药细胞，观察外源性Tnf-α基因的导入对耐药细胞的抑制及耐药性逆转作用。基因治疗目前尚处于实验室研究阶段，在进入临床试验前尚需解决许多问题。

当然，肿瘤多药耐药是一个复杂的问题，涉及基础和临床研究的许多方面，也存在如判定MDR尚无统一标准，MDR的各项检测指标有待进一步研究，逆转剂在体内难以达到体外有效逆转浓度等一些问题。MDR的机制相当复杂，不同肿瘤细胞对同一种药物可能有不同耐药机制，而同一肿瘤对一种药物也可能产生多种耐药机制，耐药甚至可能涉及到全身多系统多组织，单独针对P-gp不能解决全部问题。正是如此，肿瘤的多药耐药对临床用药的重要性、耐药逆转剂的研究已成为热点课题。随着高效低毒逆转剂和更加合理的抗肿瘤MDR药物的不断发现并逐步用于临床，在单克隆抗体技术等基因水平逆转MDR的探索、多靶点治疗药物、分子靶向药物在肿瘤治疗中的应用,根据肿瘤细胞多药耐药的机制，还可针对其他许多耐药途径设计siRNA，但仍在研究和论证之中。有理由相信不久的将来肿瘤对抗癌药物的耐受性会逐渐被克服, 使肿瘤的治疗取得突破性的进展。

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当代医学2011年21期