图 1

似乎只有Jurkat 细胞实验得出来与预测的分子量一致的条带，可是图中在大约55kD的位置也多了一条带，不好判断呢。另外三组结果，不是位置不在33kD （在 Human skeletal muscle tissue 中观察到的条带大约是40KD）, 就是有高背景的拖带现象（在 HLDM-2细胞中是40-60kD之间，在NCI-H1975细胞中是40-50kD之间），看起来更不可能正确。到底哪组是正确的呢？

我们一一根据上述的要点来排查。

1） 参考Uniprot。

理论上，Uniprot预测的分子量是33kd。但是实际上，由于PD-L1 非常容易发生糖基化修饰，在大部分样本中看到的实际分子量都是在40kD-60kD 之间的，因此，在Human skeletal muscle tissue、HLDM-2、NCI-H1975 看到的条带都是蛋白翻译后高度糖基化修饰的结果，Jurkat 细胞中55kd 的条带也是发生乙糖基化的另一条带，是PD-L1表达的另一种形式。

2） 参考抗体说明书。

以 CST 产品 PD-L1 (Extracellular Domain Specific) (E1J2J™) Rabbit mAb #15165 为例，说明书中给出的分子量是40-50 kD（如图2）, 并且在不同的样本中验证确实是在40-50kD 之间，因此，判断抗体识别蛋白的分子量最好参考抗体的说明书，以说明书为准。

图 2

另外，文献上的数据也可以参考，如图3，使用E1J2J克隆的抗体在PC9野生型的细胞中观察到的实际分子量是在40-60kD的，这是正确的蛋白表达，不能由于不是理论上的33kD 就一直纠结实验的结果。

图 3. 来自参考文献【4】 Figure. 2D

以上两点在很大程度在可以帮忙判断蛋白条带的位置是否正确。

3）& 4）样本本身裂解不完全、抗体不特异也会导致出现与预测不一样的条带。

这两点我们完全可以通过提高样本和抗体的质量来解决。

5）最后，主要是一些实验细节，比如制备的胶质量、跑胶的buffer的新鲜程度及电泳的条件和WB 实验的配套封闭液和抗体稀释液等等，都会造成条带的偏差。这里，再给大家举个例子，Bip 蛋白的分子量是78kD，GAPDH 的分子量是37kD,但是图4显示，这两个蛋白的分子量都与预期有些许偏差，但是A204 细胞是Bip 高表达的一个细胞系，而且整张膜上条带特异，背景干净，就是分子量有些偏移，这样情况的出现很大原因是与跑胶的状态有关，条带的位置即使出现了些许偏差，我们还是认为是特异正确的目的条带。

图 4. 该图来自 CST 用户

总 结

判断WB 实验条带位置正确与否一点都不难，只要下足功夫研究蛋白的基本特点、仔细阅读抗体的说明书，问题基本能解决一大半，再佐以合适的WB实验步骤，问题就引刃而解了。返回搜狐，查看更多