本文作者：图宾根大学创伤骨科中心博士祝晟

　　人口老龄化，已成为目前中国乃至全球共同关注的重要社会问题。人口老龄化是公共卫生政策和社会经济发展的成就，但也对社会提出新的挑战。几乎在所有国家中，60岁以上人口比例的增长速度比任何其它年龄组都要快，预计至2050年，全球将有1/4人口超过60岁。这是由于期望寿命延长和生育率下降共同导致的结果。在中国，从2000年以来，我国的生育总数和总和生育率持续下降。2019年我国出生人口比2018年减少58万人，出生率为10.48%，总和生育率也不会超过1.5，均是2000年以来的最低值。除了严重的社会挑战，人口老龄化也对健康问题有很大影响。

　　针对人口老龄化，世界卫生组织有三个工作重点：

　　1.预防慢性病；2.获得有益于老年人的初级卫生保健；3.创立有益于老年人的环境。其中，慢性病的预防为重中之重，其不仅决定了老年人的生活质量，也有巨大的社会经济效益。

　　由于人口老龄化的发展，骨质疏松症已成为最常见的骨相关慢性病和发病率最高的骨代谢疾病。据统计，目前预计全球有超过2亿人罹患骨质疏松症，1/3绝经后妇女受到骨质疏松症困扰。15%至40%骨质疏松症患者一生中至少遭受一次骨质疏松性骨折，这常常给老年人带来难以承受的打击，甚至导致死亡。骨质疏松症的发生由遗传、激素、环境及生活方式等因素共同影响发生的，是骨细胞动态平衡被破坏的最终结果，表现为骨密度下降和骨重塑失常。除基因、年龄和性别等，合并症（如糖尿病、炎症性肠病）、用药情况（如长期服用激素）、久坐生活方式、酗酒及长期吸烟被视为骨质疏松症重要的危险因素，也是预防和改善骨质疏松症值得关注的要点。

　　目前全世界约有逾10亿吸烟者，且可导致每年约700万人死亡，如不加以控制，这一数字可能持续增加。2021年3月31日最新《中国控烟观察》报告称吸烟和暴露于二手烟是导致各种慢性疾病的重要原因。作为可预防死亡的主要原因，香烟包含超过6000种化学物质，其中至少有150种被证明对健康有害，如癌症、血管疾病、髋部骨折、和慢性阻塞性肺病等。吸烟与骨质疏松症发展的联系近年来也被广泛提出并认可，临床研究表明长期吸烟者更易发生骨质疏松症，其可能的影响机制也被陆续提出：

　　1.吸烟可影响体内激素水平，而性激素和肾上腺皮质激素与骨质疏松症相关；

　　2.吸烟是一种强氧化剂，可对骨细胞产生氧化应激从而损伤细胞；

　　3.吸烟可影响心血管循环，导致骨骼系统血供不足从而影响骨细胞功能。然而，吸烟导致骨质疏松症的原因目前尚未有定论，需更多的研究以揭示其潜在的分子机制。

　　从2012年起，德国图宾根大学创伤骨科中心SWI研究所AndreasNussler教授开始研究吸烟对骨细胞的影响、机制及治疗方法。之前Nussler教授团队已证实香烟能通过激活氧化应激而对人成骨细胞及人软骨细胞造成细胞损害，导致细胞分化、细胞活性及细胞功能受到影响。除此之外，香烟对骨髓干细胞的分化影响也被广泛研究，香烟可通过损害干细胞表面纤毛、干扰TGF-β信号通路以及降低过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶活性（细胞自身抗氧化系统）导致骨髓干细胞分化至成骨细胞过程受到明显影响，导致骨代谢疾病。

　　本人自2014年至2017年在北京协和医院骨科完成医学硕士阶段学习，主要研究方向为骨质疏松症和骨质疏松性骨折。鉴于研究方向一致，骨质疏松症的研究需要临床研究与基础实验相结合，细胞研究往往是临床研究和应用的基础，所以我向Nussler提出了申请，并于2018年顺利前往德国图宾根大学，加入其科研团队，希望在博士阶段继续开展骨质疏松症相关研究，探讨吸烟对成骨细胞和骨髓干细胞的单细胞培养已有明确的损害效果。然而，骨质疏松症的发病机制是成骨细胞于破骨细胞数量及功能的失衡导致，成骨细胞于破骨细胞在人体骨骼系统中直接接触，其平衡不仅取决于细胞自身状态，也受到二者之间的信息交流和分子通路所调控，因此研究建立一个高效的成骨细胞与破骨细胞共培养系统对研究骨质疏松症有十分重要的科研意义。

　　目前可供选择的共培养模型有很多，如Transwell技术和Permeabledivider装置等，但这些属于间接性共培养，能满足细胞间的分子信号交流也易于分别对不同细胞种类，但是无法模拟细胞间的直接接触交流。而我们的意图是充分模拟成骨细胞与破骨细胞在体内的真实情况，因此直接共培养模型是我们的首选。要建立细胞共培养模型，首先需要解决的是选择合适细胞系、培养基、细胞比例及评价标准，这就需要大量的预实验探索。经过一年左右的尝试、讨论和验证，我们确定了以人骨肉瘤细胞系SaOS-2细胞及人白血病单核细胞系THP-1细胞分别作为成骨细胞和破骨细胞前体细胞的共培养系统。其主要突破点及优势有：

　　1.两种细胞系均为人来源肿瘤细胞系，较好的模拟人体体内环境，也易于培养，复制性强；

　　2.两种细胞可以在同一培养环境下存活（RPMI1640细胞培养基）；

　　3.既往研究破骨细胞往往需要外来添加诸如RANKL及MCS-F以诱导分化，本系统中SaOS-2细胞又极强的分化及分泌功能，可无需外加诱导剂，直接诱导THP-1细胞分化为成熟破骨细胞；

　　4.经与SaOS-2细胞及THP-1单细胞培养对比后，细胞在共培养系统有更好的细胞活性及功能表达。

　　为了建立骨质疏松模型，也为了探究吸烟对成骨细胞及破骨细胞产生的影响与机制，我们在共培养模型中将细胞暴露于香烟提取物(CSE,cigarette smoke extract)。实验中香烟均来自于目前世界第一烟草品牌“Marbollo,PMI”，提取及稀释方法均被之前研究论证并发表。我们发现CSE可剂量依赖性的降低成骨细胞和破骨细胞共培养的细胞活性和骨基质沉积，并且上调破骨细胞分化及功能。这些影响与临床上骨质疏松症变化一致。我们进一步探究造成这些影响的潜在分子机制，发现CSC可明显下调共培养系统中骨保护素（OPG）的基因及蛋白水平，导致上调的RANKL/OPG比例和破骨功能标记物水平。RANKL/OPG比例是决定破骨细胞分化及功能的重要标志，这个结果也与前述CSE提高破骨细胞功能一致，因此除了引起细胞氧化应激和直接细胞损害作用，调控RANK-OPG-RANK通路可能为香烟导致骨质疏松症的一个重要机制。

　　为了进一步验证共培养模型的有效性，以及探索对于长期吸烟者预防骨质疏松症可能的治疗方法，我们在CSE暴露下细胞中加入两种经典的双膦酸盐（阿仑膦酸钠和唑来磷酸）。双膦酸盐是目前临床最经典的抗骨质疏松药物，主要可以降低破骨细胞分化及功能以提高患者骨密度。我们发现两种双膦酸盐均可有效地减少CSE对成骨细胞和破骨细胞的影响，同时在基因和蛋白水平也可明显的下调RANK/OPG比例和破骨细胞标记物。这一方面进一步验证了此共培养模型很好的模拟临床及人体体内真实的骨骼环境，也为长期吸烟者的抗骨质疏松治疗提供参考。此外，双膦酸盐的经典分子机制为阻滞甲羟戊酸途径，近年来也被提出或与RANKL-OPG-RANK通路相关，但是结论尚有争议，我们的结果提示双膦酸盐对上调的RANKL/OPG比例有调整作用，最终可抑制破骨细胞分化和功能。

　　吸烟作为骨质疏松症最重要的危险因素之一，目前除了建议吸烟者戒烟，尚无明确治疗方法可完全解决这个风险，然而由于吸烟的高成瘾性，长期吸烟者的戒烟效果往往不佳。我们的研究成果为吸烟者的抗骨质疏松用药提供了重要的参考价值。此外，除了经典抗骨质疏松药物，由于吸烟激活氧化应激的效应近年来已被广泛认可，天然抗氧化剂（蔬菜或水果中富含的抗氧化成分）越来越受到重视。天然抗氧化剂已被证明对肺功能、血管环境以及癌症风险有保护作用，但是对骨骼系统的作用研究较少。我们既往的研究探讨过绿茶和白藜芦醇对骨细胞的影响，发现其对骨髓干细胞和成骨细胞由于吸烟损害的分化功能有积极作用。马基莓（Maquiberry），产自南美洲智利地区，是世界迄今为止所发现的抗氧化性最高的水果，其花青素含量远远高于其他水果。已有研究证明马基莓提取物对预防心血管疾病、消化系统疾病、糖尿病及肿瘤发生有明确的作用，并已投入市场（如Delphinol®）供有需要的人群使用。我们首次将马基莓提取物用于暴露在香烟条件下的人成骨细胞，发现其可通过激活Nrf2信号通路激活成骨细胞抗氧化系统，从而上调超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）发挥降低细胞反应性活性氧（ROS）的功能。Nrf2信号通路是近年来靶向治疗药物的热点之一，它不仅存在于成骨细胞中，我们首次提出马基莓提取物激活Nrf2介导的抗氧化莓表达以及降低ROS的效应，这不仅为吸烟者预防骨质疏松症，也为氧化应激相关疾病（糖尿病、衰老）提供潜在的治疗及预防手段。

　　随着全球人口老龄化的深化，可以预见骨质疏松症是目前及未来对患者、医疗以及社会造成巨大负担的骨代谢慢性病，其直接后果是患者生活质量的降低、骨折发生的危险甚至对老年人生命的威胁，高效的预防和治疗骨质疏松症应成为目前骨科领域研究的方向。

　　我们利用人肿瘤细胞系，建立了模拟人体真实骨骼环境的成骨细胞于破骨细胞共培养系统，并以香烟（骨质疏松症危险因素）以及双膦酸盐（骨质疏松症经典治疗方法）加以验证，未来可以用以探究不同原因造成的骨质疏松症的潜在机制，也可以用于不同治疗方法特别是新型药物的筛选和验证，具有极强的科研和临床参考意义。吸烟与骨质疏松症的关系已被广泛认知，但是其影响机制是多方面的，还需要深入研究以探寻适合吸烟者最佳的预防方法。我们发现吸烟与细胞氧化应激激活有直接关系，也可以通过降低OPG水平调节RANKL/OPG比例提高破骨细胞功能。经典的抗骨松药物双膦酸盐和天然抗氧化物马基莓被发现对吸烟导致的骨质疏松变化有减缓效果，这可能可以在未来用以吸烟患者治疗或预防骨质疏松症的重要手段。

　　参考文献

　　ZhuS, Häussling V, Aspera-Werz RH, Chen T, Braun B, Weng W, Histing T,Nussler AK. Bisphosphonates Reduce Smoking-Induced Osteoporotic-LikeAlterations by Regulating RANKL/OPG in an Osteoblast and OsteoclastCo-Culture Model. Int J Mol Sci. 2020 Dec 23;22(1):53. doi:10.3390/ijms22010053. PMID: 33374546; PMCID: PMC7793101.

　　ZhuS, Aspera-Werz RH, Chen T, Weng W, Braun B, Histing T, Nüssler AK.Maqui berry extract prevents cigarette smoke induced oxidativestress in human osteoblasts invitro.EXCLI J. 2021 Feb 9;20:281-296. doi: 10.17179/excli2020-3244. PMID:33628164; PMCID: PMC7898044.

　　ShengB, Li X, Nussler AK, Zhu S. The relationship between healthylifestyles and bone health: A narrative review. Medicine(Baltimore). 2021 Feb 26;100(8):e24684. doi:10.1097/MD.0000000000024684. PMID: 33663079; PMCID: PMC7909112.

　　ZhuS, Ehnert S, Rouß M, Häussling V, Aspera-Werz RH, Chen T, NusslerAK. From the Clinical Problem to the Basic Research-Co-CultureModels of Osteoblasts and Osteoclasts. Int J Mol Sci. 2018 Aug3;19(8):2284. doi: 10.3390/ijms19082284. PMID: 30081523; PMCID:PMC6121694.

　　ChenT, Ehnert S, Tendulkar G, Zhu S, Arnscheidt C, Aspera-Werz RH,Nussler AK. Primary Human Chondrocytes Affected by CigaretteSmoke-Therapeutic Challenges. Int J Mol Sci. 2020 Mar 10;21(5):1901.doi: 10.3390/ijms21051901. PMID: 32164359; PMCID: PMC7084468.

　　Aspera-WerzRH, Chen T, Ehnert S, Zhu S, Fröhlich T, Nussler AK. CigaretteSmoke Induces the Risk of Metabolic Bone Diseases: TransformingGrowth Factor Beta Signaling Impairment via Dysfunctional PrimaryCilia Affects Migration, Proliferation, and Differentiation of HumanMesenchymal Stem Cells. Int J Mol Sci. 2019 Jun 14;20(12):2915. doi:10.3390/ijms20122915. PMID: 31207955; PMCID: PMC6628373.

　　Aspera-WerzRH, Ehnert S, Heid D, Zhu S, Chen T, Braun B, Sreekumar V,Arnscheidt C, Nussler AK. Nicotine and Cotinine Inhibit Catalase andGlutathione Reductase Activity Contributing to the ImpairedOsteogenesis of SCP-1 Cells Exposed to Cigarette Smoke. Oxid MedCell Longev. 2018 Nov 6;2018:3172480. doi: 10.1155/2018/3172480.PMID: 30533170; PMCID: PMC6250005.

　　SreekumarV, Aspera-Werz R, Ehnert S, Strobel J, Tendulkar G, Heid D,Schreiner A, Arnscheidt C, Nussler AK. Resveratrol protects primarycilia integrity of human mesenchymal stem cells from cigarette smoketo improve osteogenic differentiation in vitro. Arch Toxicol. 2018Apr;92(4):1525-1538. doi: 10.1007/s00204-017-2149-9. Epub 2017 Dec20. PMID: 29264620.

　　HolzerN, Braun KF, Ehnert S, Egaña JT, Schenck TL, Buchholz A, SchyschkaL, Neumaier M, Benzing S, Stöckle U, Freude T, Nussler AK. Greentea protects human osteoblasts from cigarette smoke-induced injury:possible clinical implication. Langenbecks Arch Surg. 2012Mar;397(3):467-74. doi: 10.1007/s00423-011-0882-8. Epub 2011 Dec 8.PMID: 22160325.