图1 去线性路线的m6A circRNA实验策略

1.2

total RNA路线

这种路线在实验步骤上，和去rRNA方式（相对的是polyA方式）的m6A-seq测序基本相似。主要是在分析层面加入了m6A circRNA。既然实验简单，当然在分析上会受限制，通常作为total RNA路线分析的补充拓展，或者是m6A circRNA方向的初步试探。

具体分析的时候，文献中有两类策略：

一种是基于IP数据直接鉴定circRNA，因为circRNA的鉴定，是基于成环接口处的reads，若circRNA成环接口附近有m6A 修饰，则会被IP获取，从而鉴定出来。

一种是circRNA call peak后，去除和外显子序列交集的peak，剩余的peak则作为m6A circRNA的peak。即避开peak来源模糊的部分，不予分析。

可见，该路线的两种方法都有未知程度的m6A circRNA损失，也有部分文章使用。

我们总结如下，方便大家取舍参考。

表1 m6A circRNA研究思路对比

Part2 m6A circRNA数据挖掘方案

明白了m6A circRNA鉴定的思路，接下来就是数据挖掘啦。虽然有不同路线，但最终在数据分析时，都可以从有无m6A circRNA、m6A circRNA甲基化富集倍数两份基础数据开展分析。

另： 差异对比会有两个方向，①有无m6A对比；②分组间对比。

2.1

有无m6A对比

总的来说，如图2，鉴定出了两类circRNA后，可以从circRNA数量、circRNA类型、外显子数量、长度分布、表达量分布等角度，进行所有样本或分组间比较。可以初步了解m6A修饰的circRNA潜在的各类型特征。

图2 有无m6A circRNA对比

以图3为例，是对外显子数量的统计，横轴表示circRNA含外显子的数量，纵轴表示对应circRNA占比；颜色表示有无m6A。由图可知，对于含一个外显子的circRNA，存在m6A修饰的比例更高。

图3 有无m6A circRNA外显子数量占比

比较特别的，还可以从IRES角度对比。

真核细胞中，RNA的翻译起始可以分为两大类：

1）5’帽子依赖型翻译起始（5’ cap dependent），即通过mRNA 5’端的帽子结构，招募核糖体，起始翻译；

2）5’帽子非依赖型翻译起始（5’ cap independent），比如通过m6A、IRES（internal ribosome entry site，内部核糖体进入位点）等招募核糖体，启动翻译。其中，IRES是一段核酸序列，它的存在能够使RNA不依赖5’帽子而直接与核糖体结合，起始RNA的翻译。

circRNA没有mRNA的5’帽子结构，但可能通过IRES或m6A发挥翻译功能（图4[6]），进一步开展IRES分析，有利于评估预测circRNA的潜在翻译价值。

图4 circRNA IRES序列示例

2.2

甲基化与表达量关联分析

基于circRNA的m6A甲基化富集倍数和表达量，我们可以分别鉴定出差异表达的circRNA（DEC，Differential Expression circRNA）和差异甲基化的circRNA（DMC，Differential Methylation circRNAs）。获得DEC、DMC信息后，即可开展维恩、占比、四九象限图的多角度分析（图5），详细讨论circRNA甲基化差异与表达量差异的趋势变化，潜在关联。

图5 DEC和DMC关联分析

如图6，第一行为DMC中，表达量上调、下调、不变的circRNA比例；第二行为DEC中，甲基化上调、下调、不变的circRNA占比。左边为对应的上调统计，右边为对应的下调统计。由图第一行可知，发生m6A修饰的circRNA与表达量有较强的关联，占DMC的80%左右；剩余有20%左右circRNA表达量没有显著差异，暗示m6A有可能参与了其他过程的影响，比如circRNA的翻译。由图第二行，DEC中，仅有20%左右的circRNA有甲基化差异，暗示众多差异表达的circRNA中，还有许多m6A以外的调控机制。

图6 DEC和DMC占比统计

除了以上两类分析，基迪奥还可以开展甲基化富集倍数与表达量的相关性分析、DMC参与的CeRNA网络等。欢迎有m6A circRNA兴趣的小伙伴咨询当地销售。

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参考文献

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[1] Multifaceted regulation of translation by the epitranomic modification N6-methyladenosine. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 2021.

[2] Genome-wide maps of m6A circRNAs identify widespread and cell-type-specific methylation patterns that are distinct from mRNAs. Cell Rep. 2017.

[3] m6A-dependent biogenesis of circular RNAs in male germ cells. Cell Research. 2020.

[4] Landscape of N6-Methyladenosine Modification Patterns in Human Ameloblastoma. Front. Oncol. 2020.

[5] Identification and Characterization of N6-Methyladenosine CircRNAs and Methyltransferases in the Lens Epithelium Cells From Age-Related Cataract. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2020.

[6] CircInteractome: A web tool for exploring circular RNAs and their interacting proteins and microRNAs. RNA Biology. 2020.

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