作者对先前各种AML亚型病人的表达谱芯片数据进行了重新挖掘后发现，MLL重排的AML和t(15;17)型AML中FTO表达量显著上升。对MLL病人的CD34+骨髓细胞（BM Cell）进行qPCR验证发现，FTO表达量显著高于普通CD34+细胞。作者还对另一种去甲基化酶ALKBH5进行了分析和qPCR验证，结果发现AML和对照没有差异。

接下来作者对先前已发表2项白血病队列研究（超过500人）中的转录组结果进行重分析。结果表明t(11q23)和t(15;17)两种亚型中FTO表达量显著上升。在NK亚型中，当FLT3-ITD和NPM1发生突变时（甚至是同时发生突变），FTO蛋白表达量显著上升。

白血病原癌基因能引起FTO显著上调

作者对三种不同亚型的骨髓祖细胞进行了WesternBlot和qPCR验证。结果表明FTO无论是在RNA水平还是蛋白水平都显著上升。接下来作者从首次进行骨髓移植的受体小鼠（已发生MLL融合突变）中采集了骨髓细胞进行分析，结果发现FTO依旧显著上调。值得注意的是二次移植后MLL-AF9融合骨髓细胞中FTO表达量在原有基础上进一步上调。而ALKBH5则差异不显著。FTO过表达导致mRNA整体的m6A修饰水平下调。

为了进一步验证FTO上调是否与MLL重排相关，作者进行了ChIP实验。结果发现，在两种细胞系mono-mac-6（MLL-AF9 AML）和KOCL-48（MLL-AF4 AML）中，FTO基因的CpG岛附近MLL-C和MLL-N富集程度较高而distalupstream site则没有富集。作为常见的active gene marker之一，h3k79在本次实验中也是显著富集。作为对照，在K562细胞（一种人红白血病细胞系）中，FTO基因上的MLL-C、MLL-N和h3k79富集不显著。所以FTO倾向于直接靶向MLL融合。此外，作者在小鼠骨髓细胞中发现，当MLL-ENL-ERtm表达量降低时，FTO表达量也显著降低，而另一种去甲基化酶ALKBH5则没有任何差异。

FTO能够促进细胞增殖/转化并抑制体外凋亡

作者在两种发生MLL重排的AML细胞系mono-mac-6和mv4-11中进行了FTO敲低和过表达实验。慢病毒转染过表达载体后，FTO能够促进细胞增殖生长、生存周期增加，且mRNA整体m6A水平降低，细胞凋亡减少。FTO敲低后，前面描述的结果呈现相反趋势。此外PML-RARA/t(15;17)和FTL3-ITD/NPM1细胞系中FTO过表达和敲低也表现出相似的结果，但是在K562细胞中，FTO过表达和敲低后细胞表型变化不显著。这表明FTO是AML具有原癌作用的基因。

FTO在小鼠模型中能够促进白血病恶化

作者将发生MLL-AF9融合突变的骨髓细胞，移植到受体小鼠中。多次重复实验表明，小鼠体内FTO过表达会加速白血病病情恶化，导致小鼠存活时间降低。此外，FTO过表达还会引起小鼠体内c-Kit+干细胞数量增加，mRNA整体的m6A修饰水平下降。相反，FTO敲低的小鼠存活周期有所增加，病情恶化速度减缓。FTO单敲小鼠相对于FTO未敲除的小鼠，mRNA整体m6A修饰水平有所上升，c-Kit+干细胞数量降低。

转录组测序和m6A-seq揭示FTO对靶基因存在负调控

作者对FTO过表达的mono-mac-6（MLL-AF9AML）细胞系进行转录组测序和m6A-seq，并用空载体细胞作为对照。与对照的细胞系相比，FTO表达量提高了4~5倍，而m6A修饰水平显著降低。作者使用MACS和exomePeak两款软件鉴定出13278个m6A peak有交集。与先前的研究相似，在这13278个m6A peak中GGACmotif显著富集。这些m6A peak大部分都位于外显子上，并且在3’端的终止密码子附近富集程度较高。

接下来作者对m6A-seq中总计13000多个m6Apeak进行了比较，发现有2785个m6A peak显著下降而3180个m6A peak显著上升，所以也被称作hypo-methylated m6A peak（去甲基化m6A峰）和hyper-methylated m6A peak。在2780个去甲基化转录本中，发现275个转录本（超过85%）显著下降而47个转录本显著上调。所以AML细胞系中，这些去甲基化转录本可能就是受到FTO负调控的靶基因。

通过搜寻MSigDB（http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb）作者发现，SOX2、NANOG和LEF1三个基因显著富集在hypo-up转录本中。这些转录本属于转录因子家族，对激活Wnt信号通路以及胚胎干细胞多能性有十分重要的作用。而hypo-down转录本中，分析结果富集到了能够直接引起基因融合的PML-RARA上。作者下一步从四个AML大样本病人队列（作者实验室自有数据、TCGA和两份GSEA数据）的表达谱芯片数据和转录组测序中，对FTO与这些基因之间的关系进行了进一步数据挖掘。结果表明，hypo-down基因（ASB2, KCNG1, PPARD, RAB17, RARA, SLC11A1, SLCO4A1, TBC1D9）和hypo-up基因（C21orf59, MZF1, TXLNA）与FTO基因的表达存在负相关和正相关。

作者通过m6A qPCR实验对ASB2, PPARD, RARA, SLC11A1, TXLNA这5个基因的m6A的相对水平进行验证，结果表明TXLNA的m6A相对水平显著上升，其他四个基因m6A相对水平显著下降。这个结果表明，验证结果与测序结果一致率较高。

作者又接着使用m6A-seq对FTO敲低的MA9/FLT3-ITD白血病细胞进行测序。结果表明，FTO过表达的mono-mac-6细胞系中超过90%的去甲基化转录本在FTO敲低的MA9/FLT3-ITD白血病细胞系中m6A甲基化水平上升。通过进一步分析发现，上面那张Table S2的11个hypo基因有8个基因是hypo-down，而这个Table S3的结果也与Table S2完美契合。两个结果共同表明，这些基因都受到FTO基因的负调控。

ASB2和RARA是AML中FTO重要的靶基因

先前已有文献报道称，ASB2和RARA在造血功能正常以及用反式维甲酸（ATRA）治疗的白血病细胞中表达量会上升，并且能够显著延缓MLL病情。而在FTO过表达的白血病细胞系中，ASB2和RARA表达量显著下调，对四个独立的白血病大样本队列研究中的数据进行挖掘后也发生同样的现象。

作者通过对m6A-seq的测序数据进行分析后发现，FTO靶向ASB2的3’ UTR区和RARA的5’UTR和3’UTR（绿色框框处）。FTO过表达和敲低能够分别降低和提高两个基因在UTR的m6A水平。

下一步，作者分别在两种白血病细胞系中对FTO进行过表达。结果表明，细胞系中ASB2和RARA两种蛋白表达量显著降低。接下来作者对FTO进行了敲低实验，结果正好与FTO过表达的结果相反。另外，FTO敲低只影响了RARA蛋白但是并没有影响其他RAR家族蛋白如RARG。此外，无论是细胞核还是细胞质中，FTO敲低和过表达对ASB2和RARA影响也相似。

接下来，作者在白血病细胞系中对ASB2和RARA进行了敲低和过表达，结果发现与上个实验中FTO敲低的结果相似。相反的是，如果对ASB2和RARA进行敲低，则AML的细胞增殖和生存能力显著上升，这个结果也与FTO过表达实验非常相似。所以ASB2和RARA的敲低实验也可以认为是FTO敲低的补救实验（rescue）。

小贴士：通常高分文章都会要求老师在进行细胞实验时配以补救实验。补救实验分为单因素补救和多因素补救，也可以分为直接补救和间接补救。

FTO通过去甲基化修饰调节ASB2和RARA

为了阐释FTO调控靶基因分子机制，作者使用m6A qPCRarray证实FTO过表达和敲除会分别降低和提升靶基因ASB2和RARA的m6A水平。接下来，作者使用荧光素酶报告基因系统验证了ASB2 3’UTR、RARA 5’UTR和3’UTR能够真的被FTO直接作用。结果表明，当UTR上的m6A motif被突变后，FTO不能与其结合，且FTO被突变后也不能与UTR相结合。

为了证实是否真的与m6A相关，作者分别将ASB2和RARA的UTR载体和发生m6A motif突变的载体转染进293细胞，这些载体上带有荧光素酶报告基因，接着使用m6A qPCR来进行验证。结果表明，FTO作用下未发生突变的UTR其m6A水平显著降低，而无论是发生突变的FTO还是UTR都不能显著降低m6A水平。

阅读蛋白YTHDF2能够特异性识别这些发生m6A修饰的转录本，使得其半衰期降低。大量研究已经证实，YTHDF2介导RNA降解。换句话说，当mRNA上m6A水平上升时更容易被降解。让人意外的是，FTO靶基因ASB2和RARA受FTO负调控。通常我们会认为当FTO过表达时，靶基因m6A水平降低，半衰期延长。但是作者进行了RNA stability实验并发现FTO过表达和敲低后靶基因ASB2和RARA的半衰期分别下降和上升。这就说明FTO能引起ASB2和RARA的稳定性下降。作者在细胞系中对METTL3和METTL14进行了敲低后发现，ASB2和RARA相对表达水平显著降低，与FTO过表达结果相似。

这种结果与常规预期不太符合，表明可能存在一种新型的阅读蛋白介导FTO靶基因ASB2和RARA的稳定性。接下来作者分别对YTHDF1和YTHDF2进行了敲低实验。但是结果表明两个靶基因RNA相对表达水平和蛋白表达水平均没有受到影响。接下来作者对FTO进行敲除和过表达后，METTL3、 METTL14、 YTHDF1 和YTHDF2 表达量均不显著。作者猜测可能存在一种新型的阅读蛋白维持ASB2和RARA的稳定性，但这种蛋白目前仍然未知，未被鉴定出来。

APL细胞中FTO—|ASB2/RARA通路对全反式维甲酸治疗有应答

已知全反式维甲酸（ATRA）治疗后，NB4细胞中FTO显著下调，ASB2和RARA显著上调。作者使用ATRA对FTO过表达APL细胞进行处理后，未分化的NB4细胞（CD11b-/CD14-）数量显著上升。接下来作者对NB4细胞中的FTO进行敲低，ATRA诱导细胞分化大幅度增强，从而导致未分化的NB4细胞数量大大降低。同样，作者对ASB2和RARA进行过表达后NB4细胞分化能力增强，这个结果与FTO敲低的实验结果基本一致。因此，通过去甲基化修饰以及转录后表达ASB2和RARA的功能，FTO蛋白能够抑制ATRA诱导的APL细胞分化。这就说明过表达FTO的细胞对ATRA有一定的耐药性。

总结

这篇文章虽然篇幅较长，但是针对RNA去甲基化酶FTO与AML的关系目前仍有许多研究有待填补空白。本研究虽然没有验证维持ASB2和RARA这两个靶基因RNA稳定性的阅读蛋白，但是本篇论文详细阐释FTO介导的ASB2和RARA调控白血病发生和耐药机制，所以这是一项具有里程碑式研究。在这当中，FTO处于一个十分核心的地位，也就是说FTO对AML发挥着oncogenic role的作用。虽然大量的分子机制部分仍然欠缺，仍然为后续的药物靶点开发和深入的分子机制挖掘开辟了新思路。

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黄媛 编辑返回搜狐，查看更多