IGF2BP蛋白的鉴定

作者在之前的研究观察到，在YTHDF2介导的m6A途径中，当mRNA上的m6A含量降低时，mRNA的含量并未升高，反而显著降低。这表明，肯定有另外的阅读蛋白介导了m6A的功能。

于是，作者用ss-m6A来做RNA pulldown实验，再结合质谱分析，发现与对照组相比，IGF2BP蛋白（IGF2BP1/2/3）显著结合在了m6A上，表明它是m6A结合蛋白。接着，作者检索数据库，也证明了IGF2BP蛋白具有较强的m6A结合能力。

为了从侧面证明IGF2BP蛋白结合着m6A，作者测定IGF2BP蛋白IP下来的RNA上m6A水平，结果显示IP组的m6A水平显著高于对照组。这些结果充分表明了IGF2BP是m6A的结合蛋白。

经过m6A测序，作者发现IGF2BP蛋白主要识别并结合转录本的3’UTR处的m6A位点。作者随机选取了四个基因：MYC、FSCN1、TK1和MARCRSL1进行验证，发现在敲低甲基化酶METTL14后（即人为降低m6A水平），不论是IGF2BP2或者IGF2BP3，它们结合目的基因的能力都显著下降。

敲低IGF2BP后基因表达显著降低

接下来，作者通过RNA-seq发现，敲低IGF2BP（1/2/3）后，基因表达显著下调。通过比对数据，作者进一步发现，表达下调的基因大多是RNA结合蛋白。

为了探究敲低IGF2BP（1/2/3）导致基因表达的降低是否与m6A修饰相关，作者通过m6A-seq和RNA-seq，发现敲低METTL3或者METTL14后，IGF2BP结合的目的基因表达显著降低。这些结果表明m6A介导了IGF2BP调控基因表达。

IGF2BP调节mRNA稳定性

那么IGF2BP是如何调节基因表达的呢？通过mRNA稳定性实验，作者发现敲低IGF2BP3后，目的mRNA的稳定性显著减弱，提示，IGF2BP可能调节了目的基因的稳定性。这里插一句，作者是怎么鉴定出这些目的mRNA的呢？他们主要采用了CLIP（紫外交联免疫沉淀）和RIP（RNA结合蛋白免疫沉淀）技术抓取到了IGF2BP目的蛋白。这两种技术也是研究RNA结合蛋白功能常用的技术。

通过对目的基因MYC稳定性的检测（通过放线菌素D处理的方法），可以看到，分别敲低IGF2BP1-3后，MYC的mRNA稳定性都显著降低。

进一步，作者探究IGF2BP是如何调节mRNA稳定性。作者通过蛋白质谱发现，IGF2BP与一些RNA稳定蛋白结合在一起，如HuR、MATR3和PABPC1。通过IP实验，作者证实了IGF2BP1-3都与这些蛋白结合在一起。再通过免疫荧光实验，证实了IGF2BP蛋白可招募HuR等来促进mRNA的稳定性。

M6A介导IGF2BP调节MYC的表达

前面通过测序等手段，作者发现m6A介导了IGF2BP调控基因的表达，在这里，作者以MYC为例，进一步验证m6A是否介导了IGF2BP对MYC的调控。首先通过m6A-seq测序，发现m6A修饰位于MYC mRNA转录本上的CRD（coding region instability determinant）区域，这个结果与RIP-seq结果吻合。在METTL14敲低后，m6A水平显著降低。同时，IP结果也显示，IGF2BP结合在了CRD区域。

在确定了MYC转录本的m6A修饰位点后，作者构建了该位点的m6A突变质粒，插入双荧光素酶基因，进行双荧光素酶报告基因检测。从结果可以看到，IGF2BP1-3可与CRD区域结合，但当CRD的m6A区域突变后，IGF2BP1-3不能与CRD结合。

IGF2BP结合m6A的部位是KH结构域

那么，对IGF2BP来说，它的哪个结构域结合在了m6A上呢？IGF2BP的KH结构域是RNA结合域。通过截断实验，作者发现KH3-4结构域截断后，IGF2BP不能与m6A结合；KH1-2截断后，IGF2BP与m6A结合减弱。这表明KH3-4结构域是IGF2BP结合m6A的核心结构域，KH1-2可能起着辅助KH3-4结合的功能。

IGF2BP具有在热应激（Heat Stress, HS）下稳定mRNA的功能。作者发现，IGF2BP1-3超表达后，热应激下MYC的稳定性显著提高，但当KH3-4结构域截断后，IGF2BP1-3不能提高MYC的mRNA稳定性。这些结果充分表明了IGF2BP通过KH结构域结合m6A并调节基因表达。

IGF2BP促进癌症的发展

那么，IGF2BP具有什么功能呢？TCGA数据库显示，IGF2BP在癌症组织中高表达，表明他可能具有促癌功能。作者发现，敲低IGF2BP1-3后，HeLa和HepG2细胞增殖、迁移和侵袭显著降低。

利用Crispr-Cas9技术，作者构建了IGF2BP1-3稳定敲除肝癌细胞，通过回补实验，作者证实了IGF2BP1-3具有促进癌细胞增殖、迁移和侵袭的功能。

小结

本文虽然是2018年所发，且IGF2BP也被人进一步研究了功能，但经过本文的解读，相信大家也能从中有所科研启发。虽然关于m6A的理论框架看似构建完毕，但其中还有诸多细节未完全清晰。在这篇文章中，作者就观察到与YTHDF2功能（介导基因降解）相反的表型，于是他们顺着此表型挖掘到了IGF2BP，也算是一个创新发现。因此，希望或者正在做m6A的老师，可更多的注意实验中的细节，可能就会发现新东西。

另外，不得不提，小编阅读这么多陈建军老师的文章观感是：陈建军老师的团队执行力强。他们从不同角度、不同疾病模型、不同m6A基因等方面，发现了m6A大量的生物学功能（更多聚焦于癌症发生方面），每一篇paper的工作量都巨大。而我们联川生物也有这么一群执行力强的年轻团队，选择联川，让您具有海量数据。返回搜狐，查看更多