当我们想测定环境样品中目的微生物或者基因的丰度检测，或检测样品中目的基因或序列的绝对拷贝数，或检测基因拷贝数变异(CNV)时，在SYBR GreenI染料法检测同时，还需要用已知浓度的标准品（可根据浓度计算出具体的拷贝数）绘制标准曲线来推算样品的量。将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行qPCR反应，以标准品拷贝数的对数为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线。对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可计算出拷贝数。 

那如何获得标准品，制做曲线呢？

下面分享一个最常见的方法

（方法比较详细，做好笔记哦！）

步骤①：设计引物，标准品引物和QPCR检测引物一样即可。引物预实验，确认熔解曲线正常，产物单一，引物可用。

说明1：QPCR扩增做3个重复，扩增体系和条件一般参照说明书：2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）（货号：TSE202） 

较好的熔解曲线一般如图，峰型单一，较尖锐：

步骤②：切胶回收纯化预实验的PCR产物，做TA克隆。如果是兼并引物，需要多挑几个克隆测序，将测序结果比对，选择兼并碱基出现的次数多的那个克隆作为标准品。记录整个质粒的长度。也可以直接做全基因合成标准质粒。

说明2：克隆选用快速克隆载体，说明书：pClone007 Versatile Simple Vector Kit（货号：007VSm）

步骤③：提取质粒，用微量核酸定量仪测0D260。OD260与质粒大小一起代入公式可以算出每ul标准品的拷贝数。一般质粒浓度在20~100ng/ul可以保证测值准确。

说明3：换算单位计算的可以参考以下：

范例如下：

步骤④：制备梯度稀释的样品：

（注意以下步骤的混匀不是用枪吹打混匀，尽量试用涡旋，保证充分混匀）

A. 将取10 μL标准品加入到990 μL水，混匀稀释100倍，作为第一个样品A。

B. 从A中取10 μL样品加入到90 μL水，混匀稀释10倍，作为第二个样品B。

C. 从B中取10 μL样品加入到90 μL水，混匀稀释10倍，作为第三个样品C。

以此类推，制备6~8个梯度样品。

步骤⑤： 将做好的梯度样品上机做QPCR，一般每个样品做3~4个复孔。

较好的扩增曲线一般如图：

步骤⑥：结果下机后进行数据分析，一般最终用于做图需要有5个数据点。计算出R2值和扩增效率、标准曲线，R2需要至少0.99以上，扩增效率在90%~110%，兼并引物可放宽到80~120%。如果数据不达标，则需要重新稀释标准品重做标曲，或者重新设计引物扩增构建标准品。

最终制做好的标准曲线如图：

步骤⑦：qPCR检测环节，用DNA或cDNA样品进行qPCR基因检测，检测出来的CT值带入计算出来的标准曲线，即DNA的拷贝数对数值就出来了。

例如y = -3.69x + 36.37，(Y为CT值，X为DNA拷贝数对数值),即反推X=(CT值-36.37)/(-3.69)。

计算例子如下：

步骤⑧：收尾作图环节,根据拷贝数平均数和标准偏差，做出基因拷贝数差异图。

实验过程并不难，但想做个完美的图很难。反复做几次是常事，台上一张图，台下多次功。