二、 牛血清在细胞培养中的应用

1、牛血清与细胞培养基

细胞培养基是培养环境中最重要的成分，由培养基和牛血清混合组成的完全培养基能够提供细胞生长所必需的营养素、生长因子和激素，并能调节培养体系的 pH 值和渗透压。 目前主要有三种培养基，即基础培养基、低血清培养基和无血清培养基，三者对血清添加量的要求不同。

2、牛血清在细胞的贴壁与悬浮培养中的应用

目前主要有两种基本的细胞培养体系，一种是使细胞在人工基质上单层生长 ，即贴壁培养、微载体、片状载体等培养方式，另一种是使细胞在培养基中自由漂浮生长，即悬浮培养，其中包括全悬浮培养和需要借助载体的培养。除造血细胞系和其他一些细胞外，大多数脊椎动物细胞均具有贴壁依赖性，必须在合适的基质上培养，且该基质必须经过特殊处理，以便细胞粘附和伸展 (即组织培养处理)。但是，许多细胞系也可采用悬浮培养。

牛血清在两种培养体系中发挥的作用有所区别，如贴壁培养血清主要提供贴壁因子和营养物质，而悬浮培养则主要提供促细胞生长的因子。下表汇总了两种培养方式的特点：[5]

贴壁培养

悬浮培养

全悬浮培养

载体培养

适合包括原代细胞在内的大多数细胞类型。

适合已适应全悬浮培养的细胞以及其他一些无粘附性的细胞。

适合依赖微载体、片状载体贴壁的细胞培养。

通常需要添加5%-10%牛血清，个别细胞培养血清用量需高达20%。

含血清培养或无血清培养。

含血清培养（也有无血清微载体培养）。

方瓶、转瓶培养易于通过倒置显微镜观察细胞密度及形态。

较易传代，需要经常进行细胞计数和存活率测定，以监测生长情况。

微载体培养可观察细胞贴在载体上的细胞形态；片状载体则无法观察到细胞的实时状态。

利用酶消化或机械方法解离细胞，通常需要用牛血清终止蛋白酶的消化。

无需通过酶或机械方法解离细胞，细胞损伤较小。

当需要收获细胞时，方法同贴壁培养。

细胞生长受表面积限制，因而产量受限。

细胞生长受到其在培养基中浓度的限制，易于扩大培养规模。

细胞生长受到载体数量及表面积限制，微载体可以放大规模，片状载体则很难放大。

需要使用经过组织培养处理的容器。

可使用未经组织培养处理的容器进行培养，但需要搅动 (即摇晃或搅拌) 以便进行充分的气体交换。

需要微载体或者片状载体，在生物反应器或其他适合的容器中培养。

对于贴壁依赖性细胞，细胞的贴壁伸展过程在细胞的生长增殖中具有重要的作用。细胞在支持物表面的贴壁过程可分为三步，分别为贴壁因子粘附、细胞开始粘附、细胞进一步牢固附着并伸展。同时细胞形态由圆形变为圆饼形（放射状铺伸细胞），并逐渐展开伸展为扁平的极性细胞，这种变化有利于增加细胞与营养环境的物质交换表面积，而且只有当细胞伸展到合适状况，细胞DNA才开始合成，所以细胞伸展状况制约了细胞的分裂增殖活动过程。

细胞贴壁伸展的速度，对于贴壁细胞的生长也是重要因素之一。传代细胞贴壁伸展的越快，细胞进入生长期的时间也就越早，这样有利于细胞的生长，质量好的牛血清往往含有更多有利于细胞贴壁的因子。（上文中已有介绍）

除此之外，当科研人员将细胞扩增至一定数量后，需让细胞在容器中维持生存而不扩增时，可调整牛血清在培养基中的浓度，通常浓度约5%（根据实际使用情况需进行调整）。

牛血清在动物细胞悬浮培养的应用中依据细胞是否具有贴壁依赖性，分为动物细胞全悬浮细胞培养和动物细胞微载体悬浮培养。全悬浮细胞（如BHK21悬浮细胞株）可以在生物反应器中直接进行生产增殖，具有细胞自由生长、培养环境均一、取样简单、培养操作简单可控、放大方便、污染率和成本低的特点。贴壁细胞（ST、Vero细胞等）在生物反应器中悬浮培养时需要借助介质表面，通常是微载体，其细胞所能达到的浓度和生产产品的产量依赖于微载体提供的生长表面积。微载体为动物细胞生长提供了便利的表面，具有极大的培养表面积/体积比，它能够实现细胞高密度培养，是目前贴壁动物细胞大规模培养使用的主要介质。

在悬浮培养中，生产抗体药物的CHO细胞、生产流感（禽流感）疫苗的MDCK细胞等已经采用无血清培养。但在BHK21细胞全悬浮培养的口蹄疫疫苗生产中，牛血清仍然被广泛使用。在南美和印度，口蹄疫疫苗生产通常添加10%左右成牛血清，而国内企业采用低血清培养基弥补了基础细胞培养基的不足，但是，牛血清中的一些促细胞生长的成分还是无法被替代，通常会在培养基中添加1%-3%的牛血清，同时它还起着调节培养液酸碱度的作用。为使培养体系保持良好的混合状态和分散性，从而提高细胞生长量，需对培养体系进行搅拌，这时培养基中的牛血清即可以降低细胞的机械损伤。总而言之，牛血清因有着细胞生长必须的营养成份，所以具有极为重要的功能。

三、牛血清在大规模动物细胞培养（工业疫苗）中的应用及常见问题

1949年，恩德斯、托马斯哈克韦尔和弗雷德里克查普曼罗宾斯在《SCIENCE》杂志上报告了一种动物病毒的体外培养——脊髓灰质炎病毒（Cultivation of the Lansing Strain of Poliomyelitis Virus in Cultures of Various Human Embryonic Tissues）。这是第一篇关于在细胞培养中生长病毒的报告，开拓了以动物病毒为研究对象的新领域，为以后采用细胞培养技术生产疫苗奠定了基础[9]，这三名科学家因此获得1954年诺贝尔生理学或医学奖。

早在1962年，P.B.Capstick, R.C.Telling等科学家在《Nature》上发表了关于BHK细胞悬浮培养以及其对口蹄疫病毒的敏感性的报道，当时细胞培养采用了Eagle’s基础培养基+10%成牛血清（Bovine Serum）+10%TPB（胰蛋白胨磷酸盐肉汤/Tryptose Phosphate Broth）[10]。

1965年，R. C. TELLING等科学家发表了《Submerged Culture of Hamster Kidney Cells》 ，文中介绍了BHK-21细胞悬浮培养所用的设备及培养基。[11]

目前牛血清已广泛应用于大规模细胞培养，由于新生牛血清相对于小牛血清具有更好的细胞培养效果，且能接近胎牛血清，因此疫苗生产等大规模的生产型企业会优先考虑经济且细胞培养效果较好的新生牛血清。胎牛血清通常用于对培养条件要求较高的细胞。

但由于成牛血清价格远低于新生牛血清，且在疫苗产业发展初期已有成牛血清应用的先例，因此在印度及南美等地区国家将去除抗体的成牛血清应用于疫苗生产，如口蹄疫等兽用疫苗领域[12][13]。成牛血清不仅可以应用于细胞培养，在病毒培养中也起到了重要作用。2010年，L. Robinson 等人发表关于BHK-21细胞口蹄疫疫苗研究的文献《Foot-and-Mouth Disease Virus Exhibits an Altered Tropism in the Presence of Specific Immunoglobulins, Enabling Productive Infection and Killing of Dendritic Cells》，文中就提到了采用GMEM+1%成牛血清的病毒培养方式。[14]

用于现代生物制品生产的细胞主要有以下几类：

原代细胞

原代细胞是指直接来源于动物组织的细胞，动物组织经胰蛋白酶消化培养成单层细胞（通常贴壁生长），用于病毒的培养。如地鼠肾细胞、猴肾细胞、兔肾细胞、鸡胚细胞、牛睾丸细胞等。

传代细胞

传代细胞是可在体外连续传代的细胞系，理论上具有无限传代的寿命，传代细胞系可以通过多种方法衍生而来。如Vero细胞、BHK21细胞、CHO细胞、Namalva细胞、杂交瘤细胞株、MDCK细胞等。

二倍体细胞

二倍体细胞是指能够在一定细胞周期（即一定代次范围内进行有限传代）培养的细胞株，它们的细胞核染色体在一定代次数内仍然是二倍数的，2n细胞占80%以上。例如人二倍体细胞（HDCs）来源于正常人体组织（一般来源于人类胚胎肺、肾等组织）建立的细胞株，可进行体外传代培养，但具有一定的传代寿命（一般只能传代培养50-100代），如2BS细胞、KMB-17细胞、MRC-5细胞等。

由于使用原代细胞生产疫苗需用大量动物，每次使用时需要从头制备，并且不能完全排除外源因子污染可能，批间差异大，质量难以控制；人二倍体细胞制备条件要求较高、生产成本昂贵，限制了疫苗的推广使用；而传代细胞具有无限增殖能力，具有繁殖速度快，维持时间长，建立供疫苗使用的细胞库后容易控制外源因子污染等优点，是疫苗生产的理想基质，非常适宜于生物反应器大规模培养。

含血清培养的细胞与疫苗产品举例

细胞类型

细胞名称

人用疫苗举例

原代细胞

金黄地鼠肾细胞

乙脑、出血热、狂犬病疫苗

鸡胚成纤维细胞

麻疹疫苗

牛肾细胞

轮状病毒疫苗

人二倍体

MRC-5

风疹疫苗、水痘疫苗、狂犬病疫苗

2BS

甲肝、水痘、风疹疫苗

KMB17

甲肝疫苗

传代细胞

Vero

狂犬病、乙脑、出血热、EV71、IPV

细胞类型细胞名称

兽用疫苗举例

原代细胞

牛睾丸细胞

猪瘟

二倍体细胞

ST

细小病毒、伪狂犬、猪瘟疫苗

传代细胞

BHK21

口蹄疫、狂犬病、伪狂犬病毒疫苗

Marc145

繁殖与呼吸综合征疫苗

MDBK

牛腹泻病毒疫苗

Vero

猪流行性腹泻、犬瘟热疫苗

PK15

细小病、圆环病毒、伪狂犬病毒疫苗

根据动物细胞的类型，可采用贴壁、悬浮培养方法进行大规模培养，通常的疫苗大规模生产工艺包括转瓶培养、细胞工厂、摇瓶培养、生物反应器悬浮培养等。牛血清不仅提供细胞培养所需的营养成分、生长因子、贴壁因子，在悬浮培养时还起到保护缓冲的作用。为了加强气--液--固之间的物质传递，使培养体系保持良好的混合状态和分散性，从而提高细胞的生物量和增加生产物的积累，需对培养体系进行搅拌，培养基中的牛血清由于具有一定的粘稠度，可以降低细胞的机械损伤。

由于牛血清是动物源性的产品，在大规模细胞培养中可能产生由血清引起的细胞生长状态不佳或降低疫苗生产病毒滴度，主要表现在以下方面：

为了减少由于血清质量问题对细胞形态及病毒滴度产生的影响，选择质量较高、批间差异较小的牛血清就变得至关重要。所以血清使用者需选择向有正规生产经营资质、有完善质量、售后服务体系、可靠技术支持的品牌生产厂家购买血清产品。

四、牛血清在体外诊断试剂中的应用

天然牛血清中含有25-70g/L的蛋白及各类小分子多肽等，在体外诊断试剂（主要是在酶联免疫、化学发光等方向）中有广泛的应用，其作用与BSA（牛血清白蛋白）类似，起到保护作用[15]。

目前大致包括以下几个用途：

1、封闭液

在孔板中包被抗原抗体后，需用牛血清进行封闭。在此项应用时应注意，加入牛血清的孔板部应出现非特异性的OD值，否则，易造成假阳性。

2、稀释液

牛血清作为稀释液主要起到保护作用，其中包括酶和质控品的稀释。要求加入牛血清后的酶和质控品在规定的保存条件和有效期内，其活力和效价不应有明显的下降。因此，在更换新批次的牛血清时，应对牛血清进行灵敏度、稳定性等考察。

目前并无数据或文献表明，胎牛血清在诊断试剂领域的功能性上更胜于新生牛、小牛血清甚至于成牛血清，不过有学者指出出现溶血的血清对ELISA检测结果会有影响。以IDEXX试剂盒为例，经过多次试验一块板同时检测的结果显示，溶血对于同一批次血清有一定的影响。对于阴性或者强阳性样品的检测结果影响不大，但对于疑似可疑样品影响较大，直接影响阴阳性的判定。因此推论，用于诊断试剂的牛血清应对血清蛋白进行控制。

由于牛血清的天然不确定性，如若要一个批次的血清能满足所有诊断试剂的应用是非常困难的。因此，有些牛血清厂家借鉴细胞培养的筛选方式，对不同类型的诊断试剂也进行预筛选，尽可能精准的为诊断试剂用户提供合适的血清，如专门用于封闭血清或专门用于酶稀释的血清等。返回搜狐，查看更多