了解该工具的原理与详细解析，请点击＞＞

最新的KEGG富集分析高级版工具不但支持基因的功能富集分析，还支持代谢组数据的功能富集分析，二者原理相同，操作方法相似，以下主要以基因为例进行说明。

原理：在生物体内，不同基因相互协调行使其生物学功能，基于Pathway的分析有助于更进一步了解基因的生物学功能。KEGG是有关Pathway的主要公共数据库。 Pathway显著性富集分析以KEGG Pathway为单位，应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著性富集的Pathway。P的计算公式：

其中，N为所有基因（背景基因）的数量，n为差异基因（目的基因）的数量，M为所有基因中该pathway的数量，i为差异基因中注释到该pathway的数量，计算得到的pvalue通过FDR校正之后，以corrected-pvalue≤0.05为阈值，满足此条件的pathway定义为在差异表达基因中显著富集的pathway。

功能：

输入目的基因、代谢物列表（常见为差异基因或差异代谢物），通过预设定参数，进行KEGG富集分析并将分析结果进行精美图形可视化，输出图形有富集气泡图、富集条形图、富集圈图、z-score气泡图。

适用范围：

可对18个常见物种的基因集进行富集分析，牛、斑马鱼、人、猕猴、小鼠、大鼠、猪、秀丽线虫、果蝇、拟南芥、水稻、番茄、小麦、玉米、酵母、山羊、鸡、籼稻，并且提供2个基因组版本；

也可以自行准备研究物种的背景基因进行富集分析。注意，对于代谢组数据，必须使用自己准备的代谢物背景文件进行富集分析。

数据类型：基因

1. 输入的表格文件，支持txt(制表符分隔)文本文件、csv(逗号分隔)文本文件、以及Excel专用的xlsx格式，同样支持旧版Excel的xls(Excel 97-2003 )格式。

2. 输入文件1——富集的目的基因列表，即想要研究的基因列表：

第一列为基因id（必填），第二列可以为差异表达倍数（可选输入，不包含log2fc则无法绘制富集差异z-score气泡图），具体请查看示例文件格式。

目的基因要包含在背景基因表中。需添加列名。

3.输入文件2——背景基因总表，即所有基因的列表:

①如果是平台有提供背景文件的上述18种常见物种，可以直接选用平台提供的背景；注意点击“预览背景基因”查看基因ID类型是否与平台一致，不一致，需要先进行转换。

②不是上述18种常见物种，或基因ID类型不一致且无法转换，需要选“其他物种”,上传自备的背景文件。背景文件第一列为基因id，第二列为用于获取pathway的一个id，类型有4：

类型1：KO号，例如K10942，必须为基因大K号（K number）

类型2：ncbi-geneid，例如18053，即ncbi上得到的geneid，一连串数字组成。

类型3：kegid，例如mmu:18053，即KEGG官网上的id，可以通过KEGG注释或者KEGG官网获得

类型4：kopath，为本公司提供的类型文件，第一列为基因id，第二列为KO号，第三列为通路编号，以“，”分隔，第4列为kegid。

数据类型：代谢物

①目的代谢物文件：格式同目的基因文件。

② 背景代谢物文件：

类型1：C number, 表格由代谢物id和C number（KEGG COMPOUND Database entry id,例如C00047）这两2组成。

类型2：pathway num,表格由代谢物id、C number和pathway number(5位数字，pathway id去掉前面的字母，如00020)。

注意，同样的数据，选择类型1会富集到更多的pathway条目，注意删除不属于当前物种的pathway。

参数：

① 背景基因表类型有4种，分别为：KO，ncbi-geneid、KEGGid、kopath。

② 数据库:当背景基因表类型为keggid和ncbi-geneid时，选择相应物种库和全库都可以，但选择相应物种库能缩短运行时间；当背景基因表类型为KO类型时，建议选择相应物种库进行注释。

③ 是否包含Log2FC列：按目的基因实际勾选，不含Log2FC、无法输出富集差异气泡图。

④ 选择P值或Q值作图：P-value/Q-value

⑤ 选择前多少个通路作图：15/20/25/30

⑥ 输出图形选择：富集气泡图/富集条形图/富集圈图/z-score气泡图

输出：

① out.path.xls : 目的基因相对于背景基因的富集统计表。

② out_map： 目的基因在各个pathway map的结果图。

③ out.path.png/svg：各个pathway的B级分类的统计图（png/svg格式）（默认每次都输出）。

④ out.barplot/gradient.png/pdf：前n个显著富集条形图或气泡图（png/pdf格式）（n表示选择前多少个通路作图的数量）。

⑤ out.bubble/bubble_sp.png/pdf：前20个显著富集差异z-score气泡图（png/pdf格式）（如果通路太多，则影响图形美观和整体布局，所以该图形默认使用前20个通路绘图）。

⑥ out.circular.png/svg：前n个显著富集圈图（png/svg格式）（n表示选择前多少个通路作图的数量）。

⑦ out.bar_Gradient.xls：绘制富集圈图文件，可用该文件在动态富集圈图工具进行个性化修改。

⑧ out.edge.txt 和 out.node.txt：用这两个文件可在Cytoscape工具中绘制kegg网络图。（包括了补充连接通路和补充相邻通路）（具体参见kegg网络图）

⑨ 点击我的运行窗口中的“预览”，可以对kegg网络图进行个性化修改。（不了解该功能的用户，可以参见kegg网络图）。

注意：该功能不在输出文件中，需要自己调整后可输出png/svg格式的图形。

⑩ out.htm： 网页格式结果。

富集分析图形解读及应用请点击该链接查看详情：

富集分析相关图形详解（上篇）                                                                               

富集分析相关图形详解（下篇）

示例文件：

                目的基因列表（无差异信息）

                目的基因列表（含差异信息）

                背景基因文件

输入:

富集分析的步骤：

第1步：上传目的基因文件；

第2步：选择（或上传）背景基因文件；

第3步：提交。

方式一：使用工具自带的背景基因文件

方式二：使用自己准备的背景文件进行富集分析

输出:

① out_map： 目的基因在各个pathway map的结果图

② out.bubble/bubble_sp.png/pdf：前20个显著富集差异通路的z-score气泡图

图形解读：https://www.omicshare.com/forum/thread-6771-1-1.html

③ out.circular.png/svg：前20个显著富集差异通路圈图

图形解读：https://www.omicshare.com/forum/thread-6972-1-1.html

④ kegg 网络图 （该图需要任务运行结果页面点击“预览”，自定义选择需要展示的通路来绘制kegg网络图）

图形解读：https://www.omicshare.com/forum/thread-6779-1-1.html

⑤ out.barplot/gradient.png/pdf：前20个显著富集通路的条形图和气泡图

⑥ out.path.png/svg：各个pathway的B级分类的统计图

⑦  out.htm：网页格式结果分两个部分，上面为pathway的富集信息（图1），包括pathway名，基因数，背景基因数，P值，Q值，pathwayID，下面为每个pathway具体的基因（图2），点击pathway名可以查看基因在pathway的信息（即① out_map）

                                                                                                                 图1

                                                                                                                 图2

Q1. 为什么使用平台背景基因，任务出错？

在提交之前，强烈建议大家在选择号物种/版本/类型后点击“预览背景基因”，查看平台提供的基因跟目的基因类型是否相同。

常见出错类型：

①平台提供的是Ensembl ID，但是目的基因表是symbol或其他id类型，则需要对目的基因进行基因ID转换；

PS：基因ID转换工具教程

②Ensembl id的结构是“物种前缀＋序列类型＋数字”Ensembl ID 后面的”小数”部分为版本号，如ENSG00000121410.11，小数部分的版本号必须删除。

Q2. 为什么按照示例文件整理背景基因，却出错？

背景基因的类型一般有3种，包括kegid、ncbi-geneid、KO号。只需要准备一列gene id ，一列kegid/ncbi-geneid/KO号即可。一般较常用到的是KO号。

① 注意这里的KO号是指KEGG Orthologs，即基因大K号（如：K10942），而不是KEGG Ontologs（如KO352）；

②如下图，含有过多注释信息容易导致运行出错，这里，我们只需要保留gene id 及 k号即可。

③注意类型参数是否跟准备的文件一致。

Q3.  提交时报错常见问题：

1.提交时显示X行X列空行/无数据，请先自查表格中是否存在空格或空行,需要删掉。

2.提交时显示列数只有1列，但表格数据不止1列：列间需要用分隔符隔开，先行检查文件是否用了分隔符。

其它提示报错，请先自行根据提示修改；如果仍然无法提交，可通过左侧导航栏的“联系客服”选项咨询OmicShare客服。

【关于结果的常见问题】

Q4.为什么结果中 p value 全为1：

pvalue全为1，基本是目的基因数目与背景基因数目完全一样所致。注意，富集分析中的背景基因是当前物种所有基因的列表。

Q5. 为什么代谢通路图中会出现半绿半红的框？

一半红一半绿的框表示多个基因都属于这个基因家族，其中一个基因表达上调，另一个基因表达下调。

Q6.为什么pathway注释统计图中有不属于我物种的分类？比如我分析的物种是植物，却出现了人相关的分类名？

这是因为在选择参数时，物种类型选择了“全库”，可以根据物种进行类型选择；或者去掉不相关的分类名称。

Q7.下载图片不清晰？

kegg富集分析高级版工具同时提供位图（png）和矢量图(pdf)两种类型的图片。矢量图可以无限放大、不会出现模糊的情况。

Q8.结果图片可以修改吗？如何修改？

静态工具输出的图片无法在线修改，在结果下载包中有提供位图（png）和矢量图（pdf）两种类型图片，如需修改：

①可以将pdf图导入AI（Adobe Illustrator）等软件进行调整。

②根据输出的结果，搜索相关动态工具进行绘制。

kegg网络图可以在线进行调整。在“我的项目”中点击小眼睛“预览”可进入调整页面，并下载（位图png、矢量图pdf或svg）。