注射后16-20周，科研人员分析了小鼠骨髓中植入的人类细胞(图1B)。通过PCR扩增和下一代测序NGS对目标位点和脱靶位点OT1的编辑效果进行了分析。通过流式细胞术确定了人类细胞的比例，以及主要的人类造血细胞谱系的比例。从骨髓中免疫筛选出人CD34+造血祖细胞，利用扩增子测序的方法在HBB靶位点进行了基因分型。一部分人CD34+细胞置于半固体培养基中培养，并从培养基中分离出单个红细胞克隆进行RNA-seq检测。异种移植的人CD34+细胞也可在液体培养基中分化为红细胞。最后，从一部分骨髓中通过免疫筛选的方法得到人CD235a+红细胞，并进行RNA-seq分析。

图1. 长期异种移植的造血细胞中镰状突变的纠正研究示意图。

(A) β-珠蛋白基因(HBB)靶区放大示意图。黑色显示的序列是镰状等位基因。G10引导RNA(红线)将Cas9定位到镰状突变附近的一个位点。168个碱基的单链DNA寡核苷酸供体引起的序列变化如图红色所示。(B)大规模异种移植实验示意图，以及移植细胞的分析。

高保真Cas9有效减少了Cas9 RNP的脱靶切割

基于基因编辑技术的细胞疗法存在的主要问题是Cas9对脱靶位点切割的安全性问题，使用IDT专利的高保真HiFi Cas9有效减少了脱靶效应。在K562细胞中，GUIDE- seq显示了HBB、基因间脱靶位点OT1和其他5个脱靶位点，这5个位点均不在编码区(图2A)，将这些新发现的位点称为OT2。在K562细胞中，检测了在使用相同引导RNA的情况下，由包括野生型Cas9和多种已报道的具有高保真活性的Cas9突变体(espCas9-1.1、HF-1或IDT的Alt-R HiFi Cas9)组成的RNP对HBB、OT1和OT2的靶向作用。当使用高保真Cas9蛋白时，对OT1和OT2的脱靶编辑均降低，但在HF-1实验组中目标位点HBB的切割效率也受到了影响，因此，研究人员在后续实验中没有进一步测试HF-1突变。在HSPC中，只有IDT的Alt-R HiFi Cas9在HBB位点保持了高水平的HDR插入，并在OT1位点减少了20倍的indel形成，在OT2位点减少了10倍的indel形成(图2B)。

图2. RNP介导的CRISPR编辑实验中脱靶切割的评估。

(A) Cas9 RNP编辑的K562细胞中有代表性的脱靶位点(左)，在三个独立重复中通过GUIDE-seq检测到的脱靶位点基因组坐标 (右表)。(B)高保真Cas9变体espCas9-1.1和IDT的Alt-R HiFi Cas9在健康供体HSPC中编辑情况的比较。误差条描述了与平均值的标准偏差。

本研究开发并描述了一种纠正SCD患者造血干细胞镰状突变的方案。电转Cas9 RNP和ssODN可在长期异种移植的造血细胞中校正>20%的HBB等位基因，并且经过校正的、功能正常的红细胞会在随后的体内分化过程中实现富集。该研究还发现使用高保真HiFi Cas9在保持靶位点高效编辑的同时可减少脱靶切割。文章使用的HDR修复模板ssODN和高保真HiFi Cas9 均由IDT提供。

HiFi Cas9核酸酶

IDT的Alt-R S.p. HiFi Cas9 核酸酶 V3 是一种高保真化脓性链球菌 Cas9 蛋白，显著降低脱靶效应，即使在具有挑战的实验条件下也可进行精确的基因编辑，包含核定位序列(NLS)和C-端6-His标签。浓度为10µg/µL，Cas9核酸酶100 µg= 610 pmol。

HDR供体DNA

HDR供体DNA带有IDT专有的化学修饰，可提高供体DNA的稳定性和实现超高的修复率。提供长达200个碱基的单链HDR Donor oligos， 或长达3000个碱基的双链HDR Donor Blocks。

参考文献：

1. Wendy M., et al. (2022). High-level correction of the sickle mutation is amplified in vivo during erythroid differentiation. iScience 25, 104374.

2. Lattanzi, A., et al. (2021). Development of b-globin gene correction in human hematopoietic stem cells as a potential durable treatment for sickle cell disease. Sci. Transl. Med. 13, eabf2444.

3. Romero, Z., et al. (2018). Promise of gene therapy to treat sickle cell disease. Expert Opin. Biol. Ther. 18, 1123–1136.

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