（2）7AAD标记死细胞

7AAD(7氨基放线菌素D）是一种经典的 核酸标记染料，在流式细胞术中能够 代替PI染料用于标记死细胞，以去除死细胞对于实验结果的影响。PI染料被激发后发射的荧光波长范围很大，常规FL1、FL2,FL3都能够接收到其荧光信号，所以与FITC和PE荧光素发射的荧光波长有很大程度的重叠，因此，PI染料不宜与FITC和PE共标记。而同样标记核酸的7AAD，其发射的荧光波长比较集中，一般被PerCP荧光通道接收，基本不与FITC和PE发射的荧光重叠，可以与FITC和PE共同标记样品细胞。所以，7AAD在标记死细胞方面要明显优于PI染料。

7AAD的荧光信号被PerCP通道接收，所以7AAD不能与PerCP或PE-Cy5偶联的抗体共同标记样品细胞。标记7AAD不需要与其他荧光素偶联抗体同时标记，只需在流式上样前5min加入适量的7AAD于流式管中，就可上样分析。分析时将PerCP通道阴性的细胞设门显示于新的流式图中即可，此时流式图中的细胞都是7AAD阴性的活细胞。

（3）PE-Cy5通道非标记阳性细胞

PE-Cy5通道（通常是FL3，接收的荧光波长范围大致为655-685nm)有时可用于识别死细胞，但首先该通道必须是闲置通道，即样品细胞中没有标记该通道代表的荧光素（PE-Cy5、PerCP等）偶联抗体。选择PE-Cy5-SSC散点图，一般可看到不成群的PE-Cy5阳性细胞，这些阳性细胞的SSC值也是散在分布的，这些散在的PE-Cy5通道非标记阳性细胞一般都是死细胞，如下图所示。PE-Cy5通道非标记阳性细胞，即图A中的设门部分，将这部分细胞设门显示于FITC-PE散点圈中，如图B所示，这部分PE-Cy5通道非标记阳性细胞基本都位于对角线部分，而对角线细胞一般就是死细胞，所以，散在的PE-Cy5通道非标记阳性细胞一般就是死细胞。

利用PE-Cy5通道非标记阳性细胞区分活细胞和死细胞时，流式图分析的顺序一般是先在FSC-SSC图中选择目标细胞所在的细胞群，将其设门，然后将门内的细胞显示于PE-Cy5-SSC散点圈中，排除PE-Cy5通道非标记阳性细胞代表的死细胞，将PE-Cy5阴性细胞设门，然后将门内的细胞显示于新的流式图内分析，这时该流式图内的细胞都是活细胞，分析或者分选时就可以尽量排除死细胞的干扰了。

但是，这种排除死细胞的方法 只是一种经验方法，一般在实验要求不高或者预实验时使用， PE-Cy5通道非标记阳性细胞并不一定都是死细胞，死细胞也并不一定都位于PE-Cy5通道非标记阳性区域内，其阴性区域内也可能有一定比例的死细胞。所以，流式分析者可以借鉴这种方法区分死细胞和活细胞，但是不能将此方提作为区分死细胞和活细胞的金标准，7AAD标记法才是标记死细胞的金标准。

（4）EMA与ViD标记死细胞

只标记分析活细胞的表面抗原分子时，用7AAD鉴别死细胞和活细胞是理想且经典的方法。但是如果 分析胞内分子，如检测胞内的重要抗原分子、胞内细胞因子和胞内活化的激酶等都需要先固定样品细胞，然后用打孔剂在细胞膜上打孔，使荧光素偶联抗体能够通过细胞膜进入细胞内，与相应目标分子结合，这时 7AAD就无怯鉴别死细胞和活细胞了。如果在固定细胞前标记7AAD，固定和打孔的过程可能会使7AAD发射荧光的能力丢失，如果在上样前标记7AAD，那所有的细胞都会被标记，因为7AAD也可经过小孔进入细胞内部与DNA结合。这时，就可以用EMA(ethidiummonoazaide)和胺反应性活性染料(aminereactiveviability dye,ViD)代替7AAD在分析胞内分子时用于鉴别死细胞和活细胞。

EMA与PI和7AAD一样也是一种能够与DNA结合的荧光染料，但不能自由通过活细胞的细胞膜，当细胞死亡细胞膜通透性增加时就可以进入细胞内与DNA结合。EMA比PI和7AAD稳定，标记胞内分子时的固定和打孔操作不会影响EMA发射荧光信号的能力，在固定前标记EMA就可排除死细胞的影响。但是，EMA只有暴露在紫外条件下才能够与DNA共价结合，而且EMA的荧光信号较弱。

ViD是一种新型鉴定活细胞和死细胞的荧光染料，它与EMA一样稳定，固定和打孔的操作不会影响其发射荧光的能力，在分析胞内分子时，固定前标记ViD可鉴别死细胞和活细胞，而且其 标记过程简单，荧光信号也较强，具有较好的应用前景。

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