ViraPower 慢病毒表达系统 |
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介绍订购信息系统的生物安全性特征方法在 293FT 细胞中生产慢病毒慢病毒储备液的滴度测定转导和分析疑难解答参考文献
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成纤维细胞培养系统蛋白表达系统与载体
介绍 通过 Invitrogen ViraPower 慢病毒表达系统，可创建一种基于 HIV-1 的复制缺陷型慢病毒，用于在分裂或非分裂哺乳动物细胞中递送和表达您的目标基因。该系统的主要组件包括： 一种表达质粒，含有受所选启动子控制的目标基因以及可将构建体包装成病毒体的元件。由三种包装质粒（pLP1、pLP2 和 pLP/VSVG）组成的优化混合物，反式提供生产慢病毒所需的结构和复制蛋白293FT 细胞系，经表达质粒与包装混合物中的质粒共转染后产生慢病毒对照表达质粒，用于优化病毒生产和细胞转导，其中包含：lacZ 基因，经包装成病毒体并转导至哺乳动物细胞系后表达 β-半乳糖苷酶（包含在各表达载体中），或祖母绿荧光蛋白 (EmGFP) 基因，经包装成病毒体并转导至哺乳动物细胞系后表达 EmGFP（单独提供；见以下订购信息） 有关表达载体及相应阳性对照载体的更多信息，请参阅您所用的特定表达或对照载体的手册。 该系统的优点 使用 ViraPower 慢病毒表达系统促进目标基因基于慢病毒的表达具有以下优点： 生成基于 HIV-1 的慢病毒，可有效转导分裂和未分裂的哺乳动物细胞，从而拓宽了传统基于莫洛尼白血病病毒 (MoMLV) 的逆转录病毒系统之外的潜在应用（Naldini，1998）在培养物中或体内，将目标基因高效递送至哺乳动物细胞内（Dull 等人，1998）提供比传统基于腺病毒的表达更稳定的长期靶基因表达产生涵盖更广宿主范围的假型病毒（Yee 等人，1994）包含多个旨在增强系统生物安全性的特征本页面概述了 ViraPower 慢病毒表达系统，并提供关于以下内容的说明和指南： 将基于 pLenti 的表达载体和 Invitrogen ViraPower 包装混合物共转染至 293FT 细胞系，生产慢病毒储备液。慢病毒储备液的滴度测定。使用慢病毒储备液转导您选择的哺乳动物细胞系。检测重组蛋白的“瞬时”表达，或生成稳定转导的细胞系（如需要）。有关生成表达载体的详细信息和说明，请参阅您所用的 pLenti 载体的手册。有关培养和维持 293FT 生产细胞系的说明，请参阅 293FT 细胞系手册。这些手册随 ViraPower 慢病毒表达试剂盒提供，也可从我们的网站下载或联系技术支持部门获取。 ViraPower 慢病毒表达系统的组件 ViraPower 慢病毒表达系统使用复制缺陷型慢病毒促进靶基因向分裂和非分裂哺乳动物细胞的高效体外或体内递送。基于 Cell Genesys 开发的 Invitrogen lentikat 系统（Dull 等人，1998），ViraPower 慢病毒表达系统具有增强其生物安全性的特征，同时可在比传统逆转录病毒系统更广泛的细胞类型中进行高水平基因表达。本系统包含以下主要组件： 基于 pLenti 的表达载体，用于从中克隆目标基因。该载体还含有将表达构建体包装成病毒体所需的元件（如 5′ 和 3′LTR、Ψ 包装信号）。有关 pLenti 表达载体的更多信息，请参阅您所用的特定载体的手册。ViraPower 包装混合物，其中包含由三种包装质粒 pLP1、pLP2 和 pLP/VSVG 组成的优化混合物。这些质粒可提供辅助功能并反式提供生产慢病毒所需的结构和复制蛋白。优化的 293FT 生产细胞系，该细胞系能够在人 CMV 启动子控制下稳定表达 SV40 大 T 抗原并便于优化病毒生产。有关 293FT 细胞系的更多信息，请参阅 293FT 细胞系手册。将 ViraPower 包装混合物和包含您目标基因的 pLenti 载体共转染至 293FT 细胞中，从而产生一种用于转导目标哺乳动物细胞系的复制缺陷型慢病毒。 慢病毒工作原理 慢病毒进入靶细胞后，病毒 RNA 经过逆转录，主动导入细胞核（Lewis 和 Emerman，1994；Naldini，1999），并稳定整合到宿主基因组中（Buchschacher 和 Wong-Staal，2000；Luciw，1996）。慢病毒构建体整合到基因组后，您可以对重组蛋白的瞬时表达进行检测，也可以通过抗生素筛选生成稳定的细胞系用于长期表达研究。 VSV 包膜糖蛋白 大多数逆转录病毒载体由于其有限的嗜性和通常较低的滴度，作为基因递送载体的有用性受到限制。在 ViraPower 慢病毒表达系统中，通过使用水泡性口炎病毒 (VSV-G) 的 G 糖蛋白基因作为假型化包膜，从而生产涵盖显著更广宿主细胞范围的高滴度慢病毒载体，克服了这一限制（Burns 等人，1993；Emi 等人，1991；Yee 等人，1994）。 返回顶部K495000,K496000,K36720,K37020,K37120,K497000,K497500,K498000,K498500,K499000 系统的生物安全性特征介绍 ViraPower 慢病毒表达系统是 Dull 等人于1998年开发的基于慢病毒载体的第三代系统。这种第三代慢病毒系统包括大量安全性特征，旨在增强其生物安全性，并将其与野生型人类 HIV-1 病毒的关系降至最低。下文将讨论这些安全性特征。 ViraPower 慢病毒系统的生物安全性特征 Invitrogen ViraPower 慢病毒表达系统包括以下主要安全性特征： pLenti 表达载体在 3′LTR 中含有缺失 (ΔU3)，该缺失不影响病毒基因组在生产细胞系中生成，但会在转导靶细胞后导致慢病毒“自灭活”（Yee 等人，1987；Yu 等人，1986；Zufferey 等人，1998）。整合到转导的靶细胞中后，慢病毒基因组不再能够生产可包装的病毒基因组。系统中使用的 HIV-1 基因数量已减少到三个（即 gag、pol 和 rev）。使用水泡性口炎病毒的 VSV-G 基因代替 HIV-1 包膜（Burns 等人，1993；Emi 等人，1991；Yee 等人，1994）。将病毒基因组包装所需结构组件和其他组件的编码基因分离到4种质粒上。全部4种质粒均经过工程改造从而不含任何彼此同源的区域，以防止可能导致产生复制缺陷型病毒的不良重组事件（Dull 等人，1998）。尽管三种包装质粒能够在 293FT 生产细胞系中反式表达产生后代病毒所需的蛋白质（例如，gal、pol、rev、env），但它们都不包含 LTR 或 Ψ 包装序列。这意味着在包装的病毒基因组中实际上并不存在任何 HIV-1 结构基因，因此，不会在转导的靶细胞中表达。不能生成新的复制缺陷型病毒。在该系统中生产的慢病毒颗粒为复制缺陷型，且仅携带目标基因。不会产生其他病毒种类。由于 gag/pol mRNA 转录本中存在 HIV-1 RRE，来自 pLP1 的 gag 和 pol 基因的表达呈 Rev 依赖性。在不存在 Rev 的情况下，添加 RRE 可防止 gag 和 pol 表达（Dull 等人，1998）。在 pLenti 表达载体的 5′ LTR 上游布置了一个组成型启动子（RSV 启动子），以抵消在病毒 RNA 高效生产中对 Tat 的需求（Dull 等人，1998）。生物安全2级尽管具有上页讨论的安全性特征，但由于用该系统生产的慢病毒可转导人原代细胞，仍可能造成一些生物危害性风险。因此， 我们强烈建议您将该系统生成的慢病毒储备液作为生物安全2级（BL-2）生物体进行处理，严格遵循所有已发表的 BL-2 指南，并进行适当的废物无害化处置。此外，在创建携带潜在有害或毒性基因（例如活化癌基因）的慢病毒时，应格外谨慎。 有关 BL-2 指南和慢病毒处理的更多信息，请参阅美国疾病控制中心 (CDC) 发布的文件《微生物学和生物医学实验室的生物安全》第4版。此文档可在以下地址下载： http://www.cdc.gov/od/ohs/biosfty/bmbl4/bmbl4toc.htm 重要说明：请按照既定机构指南处理所有慢病毒。由于各个机构使用和处理慢病毒的安全要求可能有所不同，我们建议在使用 ViraPower 慢病毒表达系统之前，查阅您所在机构的健康和安全指南和/或咨询相关人员。 返回顶部 方法基本信息 介绍 ViraPower 慢病毒表达系统旨在帮助您创建一种可在哺乳动物细胞中递送和表达目标基因的慢病毒。尽管该系统旨在帮助您以简单、直接的方式表达您的目标重组蛋白，但该系统的受众是那些熟悉逆转录病毒生物学原理和逆转录病毒载体的用户。我们强烈建议用户掌握病毒生产和组织培养技术方面的应用知识。有关这些主题的更多信息，请参阅已发布的以下综述： 逆转录病毒生物学和逆转录病毒复制周期：见 Buchschacher 和 Wong-Staal (2000) 及 Luciw (1996)逆转录病毒和慢病毒载体：见 Naldini (1999)、Naldini (1998)、Yee (1999) 和 Pandya 等人 (2001)生成您的 pLenti 表达构建体 要生成含有您目标基因的 pLenti 表达构建体，请参阅您所用载体的手册获取相关说明。创建表达构建体后，您将分离质粒 DNA 进行转染。重要说明：您应通过进行适当的限制性内切酶消化，确认您的慢病毒质粒并未发生异常重组。有关详细信息，请参阅载体手册。 DNA 分离指南 用于转染到真核细胞中的质粒 DNA 必须非常纯净，未受苯酚和氯化钠污染。污染物会杀灭细胞，盐会干扰脂质体复合，从而降低转染效率。 当使用市售试剂盒从具有野生型核酸内切酶1 (endA1+) 的大肠杆菌菌株（如 Stbl3™）中分离质粒 DNA 时，确保裂解液或重悬缓冲液的溶液 I 含有 10 mM EDTA。EDTA 会使核酸内切酶失活，避免出现 DNA 切口和载体降解。或者，按照用于 endA1+ 大肠杆菌菌株的质粒纯化试剂盒中的说明进行操作。 请勿使用小提质粒 DNA 进行慢病毒生产。我们推荐使用 Invitrogen S.N.A.P. 中提试剂盒制备慢病毒质粒 DNA，该试剂盒的重悬缓冲液中含有 10 mM EDTA（见订购信息）。 ViraPower 包装混合物 pLP1、pLP2、pLP/VSVG 质粒以优化的混合物形式提供，以便在共转染至 293FT 生产细胞中后对 pLenti 表达载体进行病毒包装。ViraPower 慢病毒表达试剂盒中提供的包装混合物（195 μg，以 TE 缓冲液形式提供，浓度 1 μg/μL，pH 8.0）和 Invitrogen Lipofectamine 2000 转染试剂 (0.75 mL) 的量足以在 10 cm 培养板中进行20次共转染。 注：ViraPower 包装混合物可从 Invitrogen 单独购买，或在 ViraPower 慢病毒支持试剂盒中提供。293FT 细胞系 人 293FT 细胞系随 ViraPower 慢病毒表达试剂盒提供，以便于优化慢病毒生产（Naldini 等人，1996）。293FT 细胞系是 293F 细胞系的衍生物，可稳定且组成性表达来自 pCMVSPORT6TAg.neo 的 SV40 大 T 抗原，必须维持在含 Geneticin® 的培养基中。有关 pCMVSPORT6TAg.neo 以及如何培养和维持 293FT 细胞的更多信息，请参阅 293FT 细胞系手册。该手册随 ViraPower 慢病毒表达试剂盒提供，也可从我们的网站下载或联系技术支持部门获取。 注：293FT 细胞系也可从 Invitrogen 单独购买。 293FT 细胞在转染时的健康状况对成功的慢病毒生产具有关键影响。使用“不健康的”细胞会对转染效率产生负面影响，导致产出低滴度慢病毒储备液。为优化慢病毒生产（即生产具有预期滴度的慢病毒储备液），在用于转染之前，请按照以下指南培养 293FT 细胞： 确保细胞健康且存活率大于 90%。在含有 0.1 mM MEM 非必需氨基酸、4 mM L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、500 μg/mL Geneticin 和 10% 未热灭活的胎牛血清的完全培养基中传代和维持细胞传代前不要让细胞过度生长。使用传代次数低于16次的细胞。阳性对照 我们建议在共转染实验中加入阳性对照载体，以生成对照慢病毒储备液，其可用于帮助您优化目标哺乳动物细胞系中的表达条件。 每个 pLenti 表达载体试剂盒均包含用作表达对照的阳性对照载体（例如 pLenti6/V5-GW/lacZ）。有关每个试剂盒附带的阳性对照载体的更多信息，请参阅相应的表达载体手册。用于荧光检测的含祖母绿荧光蛋白 (EmGFP) 的对照慢病毒表达载体 (pLenti6.2-GW/EmGFP) 可从 Invitrogen 单独购买。Lipofectamine 2000 随试剂盒提供的 Lipofectamine 2000 试剂（Ciccarone 等人，1999）是一种基于阳离子脂质体的专有配方，适用于将核酸转染至真核细胞中。使用 Lipofectamine 2000 转染 293FT 细胞具有如下优势： 在 293FT 细胞中实现较高的转染效率DNA-Lipofectamine 2000 复合物可直接加入含血清培养基内的细胞中转染后无需去除复合物、无需更换或添加培养基，不过可以在 4–6 小时后去除转染复合物而不会影响活性注：Lipofectamine 2000 可从 Invitrogen 单独购买，或随 ViraPower 慢病毒支持试剂盒提供。 Opti-MEM 为便于优化 Invitrogen DNA-Lipofectamine 2000 复合物的形成，我们建议使用 Invitrogen 的 Invitrogen Opti-MEM I 减血清培养基。 推荐程序 如果您是首次使用 ViraPower 系统和 293FT 细胞生产慢病毒，您应执行正向转染程序。此程序需要在转染前一天进行 293FT 细胞铺板，以使细胞汇合度达到 90–95% 注：在以前的 ViraPower 手册中，此方案被称为替代转染方法。 替代转染方法。 如果您是有经验的慢病毒用户并且熟悉 293FT 细胞的生长特性，您可以选择执行反向转染程序。在此程序中，将 293FT 细胞添加到含有 DNA-Lipofectamine 2000 复合物的培养基中。 返回顶部 在 293FT 细胞中生产慢病毒介绍 在您创建表达您目标基因的稳定转导细胞系之前，首先需要通过将优化的包装质粒混合物和您的 pLenti 表达构建体共转染至 293FT 细胞系来生产慢病毒储备液（含有包装好的 pLenti 表达构建体）。以下部分提供了生成慢病毒储备液的实验方案和说明。 推荐转染条件 我们使用下列优化转染条件在 293FT 细胞中生产慢病毒储备液。使用这些推荐条件（10 mL 滴度至少为 1 × 105 转导单位 (TU)/ml 的病毒）生产的慢病毒量通常足以在感染复数 (MOI) = 1 时转导至少 1 × 106 个细胞。例如，在6孔板中以 1 × 105 个细胞/孔铺板的10个细胞孔分别用 1 mL 的 1 × 105 TU/mL 病毒储备液进行转导，即可达到 MOI = 1。 条件数量组织培养板大小10 cm（每种慢病毒构建体使用一块培养板）要转染的 293FT 细胞数6 × 106 个细胞ViraPower 包装混合物的量9 μgpLenti 表达质粒的量3 μgLipofectamine 2000 的量36 μL注：您可使用其他组织培养形式生产慢病毒储备液，但请注意需要进行优化才可获得预期滴度。 需要的材料 您需要以下材料： ViraPower 包装混合物（在试剂盒中以溶液形式提供）含有您目标基因的 pLenti 表达载体 (0.1–3.0 μg/μL)含有 lacZ 的 pLenti 对照载体（随试剂盒提供）或含有 EmGFP 的 pLenti 对照载体（单独购买）在适当培养基（即含有 10% FBS、4mM L-谷氨酰胺、1 mM MEM 丙酮酸钠、0.1 mM MEM 非必需氨基酸、1% 青霉素-链霉素和 500 μg/mL Geneticin 的 D-MEM）中培养的 293FT 细胞注：MEM 丙酮酸钠为细胞提供额外的能量来源，可从 Invitrogen 购得 100 mM 储备液（货号 11360-070）。Lipofectamine 2000 转染试剂（随试剂盒提供；在 4°C 条件下储存并在使用前轻轻混匀）Opti-MEM I 减血清培养基（预热至 37°C）胎牛血清（FBS，货号 16000-044）不含抗生素的完全生长培养基（即含 10% FBS、4 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM MEM 非必需氨基酸和 1 mM MEM 丙酮酸钠的 D-MEM），预热至 37°C10 cm 无菌组织培养板（慢病毒构建体、阳性对照和阴性对照各使用一块培养板）无菌组织培养用品15 mL 无菌带盖锥形管可选：Millex-HV 0.45 μm PVDF 过滤器（Millipore，货号 SLHVR25LS）或等效产品冻存管正向转染程序 如果您是新用户，请按照以下程序共转染 293FT 细胞。我们建议您在实验中设置一组阴性对照（无 DNA、无 Lipofectamine 2000），以帮助您评估实验结果。 转染前一天（第1天），将 293FT 细胞铺于 10 cm 组织培养板中，使其在转染当天达到 90–95% 的汇合度（即 10 mL 含血清生长培养基中有 5 × 106 个细胞）。请勿在培养基中加入抗生素。转染当天（第2天），从 293FT 细胞中去除培养基，更换为 5 mL 含血清的生长培养基（或 Opti-MEM I 培养基）。请勿在培养基中加入抗生素。对于每份转染样本，按如下所述制备 DNA-Lipofectamine 2000 复合物： 在 5 mL 无菌管中，将 9 μg ViraPower 包装混合物和 3 μg pLenti 表达质粒 DNA（共 12 μg）稀释在 1.5 mL 不含血清的 Opti-MEM I 培养基中。轻轻混匀。使用前，在一支单独的 5 mL 无菌管中轻轻混合 Lipofectamine 2000，然后取 36 μl 稀释在 1.5 mL 不含血清的 Opti-MEM I 培养基中。轻轻混匀并室温孵育5分钟。孵育5分钟后，混合稀释后的 DNA 和稀释后的 Lipofectamine 2000。轻轻混匀。在室温下孵育20分钟以形成 DNALipofectamine 2000 复合物。该溶液可能呈浑浊状态，但这不会影响转染。将 DNA-Lipofectamine 2000 复合物逐滴加入每个细胞培养板中。轻轻前后晃动培养板混匀。将细胞在 37°C、含 5% CO2 的加湿培养箱内孵育过夜。次日（第3天），去除含有 DNALipofectamine 2000 复合物的培养基，更换为 10 mL 不含抗生素的完全培养基。在 37°C、含 5% CO2 的加湿培养箱中孵育。注：VSV G 糖蛋白的表达会导致 293FT 细胞融合，从而出现名为合胞体的大型多核细胞。这种形态变化是正常现象，不会影响慢病毒的生产。转染后 48–72 小时（第 4–5 天），通过将培养基移入 15 mL 无菌加盖锥形管中，收获含病毒的上清液。无论是在转染后48小时还是72小时采集上清液，均观察到病毒产量存在微小差异。注意：请记住，您在此阶段处理的是传染性病毒。请遵循关于处理 BL-2 生物体的推荐指南。在 4°C 下以 3000 rpm 离心上清液15分钟，以沉淀碎片。可选：通过 Millex-HV 0.45 μm 或等效 PVDF 过滤器过滤病毒上清液。用移液管将病毒上清液移入冻存管中，每管移入 1 mL 等分试样。将病毒储备液储存在 –80°C 下。继续测定您的慢病毒储备液滴度。反向转染程序 如果您是有经验的用户，您可以使用以下快速程序来共转染 293FT 细胞。我们建议您在实验中设置一组阴性对照（无 DNA、无 Lipofectamine 2000），以帮助您评估实验结果。每份样本需要 6 × 106 个 293FT 细胞。 在第1天，按如下所述为每份转染样本制备 DNA-Lipofectamine 2000 复合物： 在 5 mL 无菌管中，将 9 μg ViraPower 包装混合物和 3 μg pLenti 表达质粒 DNA（共 12 μg）稀释在 1.5 mL 不含血清的 Opti-MEM I 培养基中。轻轻混匀。使用前，在一支单独的 5 mL 无菌管中轻轻混合 Lipofectamine 2000，然后取 36 μl 稀释在 1.5 mL 不含血清的 Opti-MEM I 培养基中。轻轻混匀并室温孵育5分钟。孵育5分钟后，混合稀释后的 DNA 和稀释后的 Lipofectamine 2000。轻轻混匀。在室温下孵育20分钟以形成 DNALipofectamine 2000 复合物。该溶液可能呈浑浊状态，但这不会影响转染。当形成 DNA-脂质体复合物时，用胰蛋白酶消化 293FT 细胞并进行计数。将细胞以 1.2 × 106 个细胞/mL 的密度重悬于含血清的生长培养基（或 Opti-MEM I 培养基）中。请勿在培养基中加入抗生素。将 DNA-Lipofectamine 2000 复合物添加到 10 cm 组织培养板上的 5 mL 含血清生长培养基（或 Opti-MEM I 培养基）中。请勿在培养基中加入抗生素。向含培养基和 DNA-Lipofectamine 2000 复合物的培养板中加入 5 mL 293FT 细胞悬液（共 6 × 106 个细胞）。轻轻前后晃动培养板混匀。将细胞在 37°C、含 5% CO2 的加湿培养箱内孵育过夜。次日（第2天），去除含有 DNALipofectamine 2000 复合物的培养基，更换为 10 mL 不含抗生素的完全培养基。将细胞在 37°C、含 5% CO2 的加湿培养箱内孵育过夜。注：VSV G 糖蛋白的表达会导致 293FT 细胞融合，从而出现名为合胞体的大型多核细胞。这种形态变化是正常现象，不会影响慢病毒的生产。转染后 48–72 小时（第 3–4 天），通过将培养基移入 15 mL 无菌加盖锥形管中，收获含病毒的上清液。无论是在转染后48小时还是72小时采集上清液，均观察到病毒产量存在微小差异。注意：请记住，您在此阶段处理的是传染性病毒。请遵循关于处理 BL-2 生物体的推荐指南。在 4°C 下以 3000 rpm 离心上清液15分钟，以沉淀碎片。可选：通过 Millex-HV 0.45 μm 或等效 PVDF 过滤器过滤病毒上清液。用移液管将病毒上清液移入冻存管中，每管移入 1 mL 等分试样。将病毒储备液储存在 –80°C 下。继续测定您的慢病毒储备液滴度。如果您计划将您的慢病毒构建体用于体内应用，我们建议在（上述）低速离心步骤后通过 0.45 μm 无菌低蛋白结合过滤器过滤您的病毒上清液，以除去任何残余细胞碎片。我们建议使用 Millex-HV 0.45 μm PVDF 过滤器（Millipore，SLHVR25LS）进行过滤。如果您希望浓缩病毒储备液以获得更高的滴度，请先进行过滤步骤，再浓缩病毒储备液。 浓缩病毒 可采用多种方法浓缩 VSV-G 假型慢病毒，而不会对其转导细胞的能力产生显著影响。如果您的细胞转导实验需要使用相对较高的 MOI 值，您可能希望在测定滴度和继续转导前先浓缩病毒。有关通过超速离心浓缩病毒上清液的详细信息和指南，请参阅已发表的参考文献（Yee，1999）。 长期储存 将病毒储备液置于冻存管中在 –80°C 下长期储存。不建议反复冻融，否则可能导致病毒滴度损失。如果储存得当，适当滴度的病毒储备液应可使用长达1年。在长期储存后，我们建议在转导您的目标哺乳动物细胞系之前，重新测定病毒储备液的滴度。 扩大病毒生产规模 如有需要，可扩大共转染实验的规模以生产更大量的慢病毒。例如，我们已经将共转染实验从 10 cm 培养板扩大到 T-175 cm2 培养瓶，并收获了高达 30 mL 的病毒上清液。如果您希望扩大共转染规模，请记住您需要根据培养容器表面积的差异按比例增加细胞铺板数量以及 DNA、Lipofectamine 2000 和培养基的用量。 返回顶部 慢病毒储备液的滴度测定介绍 在进行转导和表达实验之前，我们强烈建议您测定慢病毒储备液的滴度。虽然在某些应用中并不需要，但在以下情况下必须执行此程序： 您希望控制慢病毒的整合拷贝数您希望生成可重现的表达结果本部分提供了关于测定慢病毒储备液滴度的指南和实验方案。注：如果您使用 pLenti6.2-GW/EmGFP 表达对照载体生产慢病毒储备液，请参阅用户手册以了解通过荧光检测进行滴度测定的方法。 注意 请记住，您将处理包含传染性病毒的培养基。遵循关于处理 BL-2 生物体的推荐联邦和机构指南。 在经认证的生物安全柜内执行所有操作。使用消毒剂处理含有病毒的培养基。用消毒剂处理用过的移液器、移液器吸头和其他组织培养用品，并作为生物危害性废物进行处置。处理病毒储备液和含病毒的培养基时，请穿戴手套、实验室工作服和防护眼镜或护目镜。实验概述 要测定慢病毒储备液的滴度，您将： 制备您的慢病毒储备液的10倍系列稀释液。在存在多聚阳离子聚凝胺的情况下，将慢病毒的不同稀释液转导至哺乳动物细胞系（推荐使用 HT1080）中。使用杀稻瘟菌素筛选稳定转导的细胞。对各稀释液中的抗杀稻瘟菌素集落进行染色并计数。影响病毒滴度的因素 许多因素会影响病毒滴度，包括： 目标基因的大小。滴度会随着插入片段大小的增加而降低。我们已经确定，插入片段大小超过 4 kb 时，每 kb 的病毒滴度下降约2倍。如果您希望生产含 >4 kb 插入片段的慢病毒，则需要浓缩病毒以获得合适的滴度。野生型 HIV 基因组的大小约为 10 kb。由于 pLenti 载体表达所需的元件大小总计约为 4-4.4 kb，因此插入片段的大小不应超过 5.6 kb。用于滴度测定的细胞系的特征——我们强烈推荐将人纤维肉瘤细胞系 HT1080 作为可重复测定慢病毒滴度的“金标准”。但是，也可以使用其他细胞系。一般而言，这些细胞应为贴壁非迁移细胞系，倍增时间范围为 18-25 小时。慢病毒储备液的储存时间——在 –80°C 下长期（>1年）储存时，病毒滴度可能会下降。如果慢病毒储备液储存时间超过6个月，我们建议在使用前测定慢病毒储备液的滴度。冻融循环次数——每次冻融循环后，病毒滴度可降低多达 10%。慢病毒储备液储存不当——慢病毒储备液应置于冻存管中在 –80°C 下储存。选择用于测定滴度的细胞系 我们强烈推荐使用人纤维肉瘤细胞系 HT1080（ATCC，货号 CCL-121）作为可重复测定慢病毒滴度的“金标准”。但是，您可能希望使用您将用于进行表达研究（例如，如果您正在使用分裂细胞系或非原代细胞系进行表达研究）的相同哺乳动物细胞系来测定慢病毒储备液的滴度。如果您拥有多种慢病毒构建体，我们建议您使用相同的哺乳动物细胞系测定慢病毒构建体的滴度。有关用于测定滴度的细胞的更多信息，请参见“影响病毒滴度的因素”。 抗生素筛选 pLenti 表达构建体包含杀稻瘟菌素抗性基因 (bsd)（Kimura 等人，1994）或 Zeocin™ 抗性基因（Calmels 等人，1991；Drocourt 等人，1990），可分别对稳定转导慢病毒构建体的哺乳动物细胞进行杀稻瘟菌素筛选（Takeuchi 等人，1958；Yamaguchi 等人，1965）或 Zeocin™ 筛选（Mulsant 等人，1988）。您购买的 ViraPower 慢病毒表达试剂盒中会提供杀稻瘟菌素或 Zeocin。杀稻瘟菌素或 Zeocin 还可从 Invitrogen 单独购买，或在 ViraPower 慢病毒支持试剂盒中提供 重要说明：细胞密度会影响 Invitrogen Zeocin 筛选的效率。要实现高效 Zeocin 筛选，细胞汇合度不应超过 50%。 测定抗生素敏感性 由于您将使用杀稻瘟菌素或 Zeocin 筛选稳定转导的细胞，因此必须首先确定杀灭您的未转导哺乳动物细胞系所需的杀稻瘟菌素或 Zeocin 的最低浓度（即进行杀灭曲线实验）。通常，2-10 μg/mL 浓度范围的杀稻瘟菌素或 50–1000 μg/mL 浓度范围的 Zeocin 足以杀灭大多数未转导的哺乳动物细胞系。我们建议您测试一系列浓度（参见下文方案），以确保您可确定您的细胞系所需的最低浓度。 在汇合度约为 25% 时对细胞进行铺板。准备一组 6–7 块培养板。让细胞贴壁过夜。次日，根据情况将培养基更换为含不同浓度杀稻瘟菌素或 Zeocin 的培养基。每 3–4 天补充一次选择性培养基，并观察存活细胞的百分比。确定在加入抗生素后 10–14 天内可杀灭细胞的杀稻瘟菌素或 Zeocin 适当浓度。Zeocin 对敏感和耐药细胞的影响 Zeocin 杀灭细胞的方法与其他常见抗生素（如杀稻瘟菌素或 Geneticin）截然不同。Zeocin™ 敏感细胞不会变圆和从培养板上分离，但可能表现出以下形态变化： 大小显著增加（类似于巨细胞病毒感染允许细胞的影响）细胞形状异常细胞质中存在大空囊泡（内质网和高尔基体或支架蛋白分解）质膜和核膜分解（这些膜上出现许多孔）最终这些“细胞”将完全分解，仅留下蛋白质“串”。Zeocin™ 耐药细胞应继续定期分裂，形成不同的集落。与未选择的细胞相比，Zeocin™ 耐药细胞不应存在任何明显的形态学变化。 转导过程中使用聚凝胺 如果在存在海美溴铵（聚凝胺）的情况下转导细胞，慢病毒转导可能会增强。为获得最佳结果，我们建议在存在聚凝胺的情况下进行转导。但请注意，有些细胞对聚凝胺 (Polybrene®) 敏感（如原代神经元）。在进行任何转导实验之前，您可能要测试细胞系对 0-10 μg/mL 范围内聚凝胺的敏感性。如果您的细胞对聚凝胺 (Polybrene®) 敏感（例如表现出毒性或表型变化），则在转导过程中请勿添加聚凝胺。在这种情况下，仍可通过慢病毒成功转导细胞。 准备和储存聚凝胺 按照以下说明准备聚凝胺（Sigma，货号 H9268）： 在去离子无菌水中制备 6 mg/mL 储备液。过滤灭菌，并以 1 mL 等分试样分装到无菌微量离心管中。工作储备液可在 4°C 条件下储存最长2周。可在 –20°C 下长期储存（最长1年）。储备液的冻融次数不得超过3次，否则可能导致活性损失。需要的材料 您需要以下材料： 您的 pLenti 慢病毒储备液（使用前储存在 –80°C 下）选择的贴壁哺乳动物细胞系适合您的细胞系的完全培养基6 mg/mL 聚凝胺（如需要）6孔组织培养板10 cm 组织培养板（仅适用于 Zeocin 筛选）杀稻瘟菌素（10 mg/mL 储备液）或 Zeocin（100 mg/mL 储备液）（视情况而定），用于筛选结晶紫（Sigma，货号 C3886；在 10% 乙醇中制备 1% 结晶紫溶液）磷酸盐缓冲盐水转导和滴度测定程序 按照以下程序，使用选择的哺乳动物细胞系测定慢病毒储备液的滴度。每份待测定滴度的慢病毒储备液至少使用一块6孔板（1个模拟孔加5个稀释液孔）。注：如果您已经生成了 lacZ 表达对照的慢病毒储备液（例如，pLenti6/V5-GW/lacZ），我们建议您也测定该储备液的滴度。如果您使用 pLenti6.2-GW/EmGFP，请参阅此载体的用户手册以了解滴度测定实验方案。 转导前一天（第1天），用胰蛋白酶消化细胞并进行计数，将其铺于6孔板中，使其在转导时达到 30–50% 的汇合度。将细胞在 37°C、含 5% CO2 的加湿培养箱内孵育过夜。示例：使用 HT1080 细胞时，我们通常在6孔板中以 2 × 105 个细胞/孔进行铺板。在转导当天（第2天），解冻慢病毒储备液，并制备 10-2 至 10-6 范围的10倍系列稀释液。对于各稀释液，将慢病毒储备液稀释于完全培养基中至最终体积为 1 mL。请勿涡旋。注：如果需要，可以制备更大范围的系列稀释液（10-2 至 10-8）。从细胞中去除培养基。轻轻倒置混匀每份稀释液，并添加到一个细胞孔中（总体积 = 1 mL）。向每孔中加入聚凝胺（如需要）至最终浓度 6 μg/mL。轻轻涡旋培养板以混匀。在 37°C、含 5% CO2 的加湿培养箱内孵育过夜。次日（第3天），去除含病毒培养基，并更换为 2 mL 完全培养基。在 37°C、含 5% CO2 的加湿培养箱内孵育过夜。次日（第4天），按如下方式处理细胞： 对于杀稻瘟菌素筛选，去除培养基，并更换为含有适量杀稻瘟菌素的完全培养基，以筛选稳定转导的细胞。对于 Zeocin 筛选，去除培养基，并使用 PBS 洗涤细胞一次。对于每孔细胞，用胰蛋白酶消化细胞，并将全部细胞重新铺于一块 10 cm 培养板上含有适量 Zeocin 的完全培养基中，以筛选稳定转导的细胞。每 3-4 天将培养基更换为含抗生素的新鲜培养基。筛选 10-12 天后（第 14-16 天），模拟孔中不应出现活细胞，而一个或多个稀释液孔中出现离散的抗生素耐药集落。去除培养基，并使用 PBS 洗涤细胞两次。加入结晶紫溶液（在6孔培养皿中加入 1 mL；在 10 cm 培养板中加入 5 mL），并在室温下孵育10分钟。去除结晶紫染料，并使用 PBS 洗涤细胞。重复洗涤。对蓝染集落进行计数，并测定慢病毒储备液的滴度。预期结果 当使用 HT1080 细胞测定 pLenti 慢病毒储备液滴度时，我们通常可以获得 1 - 5 × 105（未浓缩病毒）至 2 × 107（浓缩病毒）转导单位 (TU)/mL 的滴度。 预期结果示例 在本实验中，使用上述实验方案生成了 Lenti6/V5-GW/lacZ 慢病毒储备液，并通过超速离心进行浓缩。按照实验方案，用慢病毒上清液的10倍系列稀释液（102 至 106 稀释液）转导 HT1080 细胞或不进行转导（模拟）。转导后48小时，使用杀稻瘟菌素 (10 μg/mL) 筛选细胞。筛选10天后，用结晶紫对细胞进行染色，并进行集落计数。 后续步骤 请务必注意，用户经验、基因的性质和载体骨架可能会影响病毒滴度。如果未浓缩病毒的滴度适当（即 1 × 105 TU/mL 或更高），则继续进行“使用慢病毒转导细胞”。如果浓缩慢病毒储备液的滴度小于 1 × 105 TU/mL，我们建议生产新的慢病毒储备液。请参阅疑难解答部分，了解关于优化病毒产量的更多贴士和指南。 返回顶部 转导和分析介绍 生成具有适当滴度的慢病毒储备液后，即可将慢病毒构建体转导至选择的哺乳动物细胞系中，并检测重组蛋白表达情况。下方提供了指南。 您的慢病毒构建体在 3′LTR 中含有缺失，导致慢病毒在转导至哺乳动物细胞中后自灭活。一旦整合到基因组中，慢病毒不能再生产可包装的病毒。 瞬时与稳定表达 在将您的慢病毒构建体转导至选择的哺乳动物细胞系后，您可以通过以下方法检测目标基因的表达情况： 合并异质性细胞群并在转导后直接检测表达情况（即“瞬时”表达）。请注意，转导后，您必须等待至少 48–72 小时再收获细胞，以使表达的蛋白在转导细胞中蓄积。根据情况，使用杀稻瘟菌素或 Zeocin 筛选稳定转导的细胞。这需在转导后至少 10-12 天时进行，此外要生成稳定表达目标基因的克隆细胞系。注：在转导和筛选后，我们观察到靶基因至少稳定表达6周。测定细胞系的抗生素敏感性 如果您想要筛选稳定转导的细胞，必须首先确定杀灭您的未转导哺乳动物细胞系所需的杀稻瘟菌素或 Zeocin（视情况）的最低浓度（即进行杀灭曲线实验）。如果您在用于进行稳定表达实验的相同哺乳动物细胞系中测定慢病毒构建体滴度，则您可以使用与滴度测定所用浓度相同的杀稻瘟菌素或 Zeocin 进行筛选。 感染复数 (MOI) 为优化目标基因的表达，您需要使用合适的 MOI 将慢病毒构建体转导至您选择的哺乳动物细胞系中。MOI 是指每个细胞的病毒颗粒数量，通常与整合事件的数量相关，并且因此与目标基因的表达相关。通常，随着 MOI 的增加，表达水平呈线性增加。 确定最佳 MOI 许多因素可影响最佳 MOI，包括哺乳动物细胞系的性质（例如，非分裂细胞与分裂细胞类型；见以下“建议”）、其转导效率、您的目标应用和您的目标基因的性质。如果您是首次将慢病毒构建体转导至选择的哺乳动物细胞系中，我们建议使用一系列 MOI（例如0、0.5、1、2、5、10）来确定在您的应用中实现最佳蛋白表达所需的 MOI。 一般而言，我们发现当以约为1的 MOI 转导时，活跃分裂细胞系（例如 HT1080）中 80-90% 的细胞表达靶基因。一些非分裂细胞类型转导慢病毒构建体的效率较低。例如，当以约为1的 MOI 转导时，人原代成纤维细胞培养物中仅约 50% 的细胞表达靶基因。如果您正在将慢病毒构建体转导至非分裂细胞类型，您可能需要提高 MOI（例如 MOI = 10）以达到最佳的重组蛋白表达水平。 阳性对照 可提供表达 lacZ 或 EmGFP 的对照慢病毒载体用于优化。如果您已经生成了 lacZ 表达对照的慢病毒储备液（例如，pLenti6/V5-GW/lacZ），我们建议使用该储备液帮助您确定特定细胞系和应用的最佳 MOI。将对照慢病毒转导至您选择的哺乳动物细胞系中后，编码 β-半乳糖苷酶或 EmGFP 的基因将发生组成性表达，并可轻松进行检测（检测方法见表达载体或表达对照载体手册）。 通过从 293FT 生产细胞中收获用过的含病毒培养基，生成病毒上清液。用过的培养基缺乏营养物质，可能含有一些有毒的代谢废物。如果您使用大量病毒上清液来转导哺乳动物细胞系（例如，6孔板中每孔使用 1 mL 病毒上清液），请注意在转导过程中细胞的生长特性或形态可能会受到影响。在转导后，当培养基更换为新鲜的完全培养基时，这种效应通常会得到缓解。 需要的材料 您需要以下材料： 您的已测定滴度的慢病毒储备液（使用前储存在 –80°C 下）选择的哺乳动物细胞系适合您的细胞系的完全培养基6 mg/mL 聚凝胺（如需要）适用于您的应用的适当尺寸组织培养板杀稻瘟菌素或 Zeocin（如果要筛选稳定转导细胞，视情况选择）转导程序 根据以下程序使用您的慢病毒构建体转导选择的哺乳动物细胞系。提醒：如果您正在进行 Zeocin 筛选，请记住在筛选时细胞不应汇合（参见下文步骤6）。进行相应的细胞铺板。 根据您的应用，将细胞铺于完全培养基中。在转导当天（第1天），解冻慢病毒储备液，并在必要时将适量病毒稀释于新鲜的完全培养基中，以获得合适的 MOI。保持含病毒培养基的总体积尽可能低，以最大限度地提高转导效率。请勿涡旋。从细胞中去除培养基。用移液器轻轻混合含病毒的培养基，并加入细胞中。加入聚凝胺 (Polybrene®)（如需要）至最终浓度 10 μg/mL。轻轻涡旋培养板以混匀。在 37°C、含 5% CO2 的加湿培养箱内孵育过夜。注：如果您正在使用未稀释的病毒储备液转导细胞，并担心过夜孵育可能引起的毒性或生长效应，则可将更换培养基前的细胞孵育时间缩短至6小时。次日（第2天），去除含病毒培养基，并更换为新鲜的完全培养基。在 37°C、含 5% CO2 的加湿培养箱内孵育过夜。次日（第3天），请执行以下操作之一： 如果您正在进行瞬时表达实验，请收获细胞并检测重组蛋白的表达情况。去除培养基，并根据情况更换为含有适量杀稻瘟菌素或 Zeocin™ 的新鲜完全培养基，以筛选稳定转导的细胞。继续步骤7。每 3-4 天将培养基更换为含抗生素的新鲜培养基，直至可鉴定出抗生素耐药集落（一般为筛选后 10–12 天）。挑取至少5个抗生素耐药集落（参见下方注释）并扩增每个克隆以检测重组蛋白的表达情况。慢病毒整合至基因组的过程是随机过程。根据整合位点周围基因组序列的影响，您可能会发现不同的抗生素耐药克隆呈现不同水平的重组蛋白表达。我们建议至少检测5个抗生素耐药克隆，并选择能够实现最佳重组蛋白表达的克隆用于进一步研究。 检测重组蛋白 您可以使用任一可选方法检测您的目标重组蛋白，包括功能分析、免疫荧光或蛋白质免疫印迹。如果您已将目标基因克隆到含有表位标签的框内，则可以使用抗该表位标签的抗体通过蛋白质免疫印迹轻松检测重组蛋白 返回顶部 疑难解答下表列出了一些潜在的问题和可能的解决方案，可以帮助您解决共转染和滴度测定实验中的问题。 生成慢病毒储备液 问题原因解决方案病毒滴度低转染效率低：使用的表达构建体质粒 DNA 的质量较差（即来自小提的质粒 DNA）293FT 细胞不健康；细胞活力低在含抗生素（即 Geneticin）的培养基中对细胞进行了转染质粒 DNA:转染试剂比例不合适共转染不充分293FT 细胞铺板太稀疏请勿使用小提质粒 DNA 进行转染。使用 S.N.A.P.中提 DNA 分离试剂盒或通过 CsCl 梯度离心制备质粒 DNA。使用传代次数低于16次的健康 293FT 细胞；请勿过度生长。尽管稳定维持 293FT 细胞需要 Geneticin，但在转染过程中请勿向培养基中添加 Gibco Geneticin，否则会降低转染效率和导致细胞死亡。DNA（单位：μg）:Lipofectamine 2000（单位：μL）比例保持在 1:2 至 1:3 范围内。使用更多的 DNA/Lipofectamine 2000（保持比例不变）。例如，使用 5 μg 慢病毒载体、15 μg 包装混合物和 60 μL Lipofectamine 2000 进行转染。进行细胞铺板，使其在转染时达到 90–95% 的汇合度，或使用反向转染实验方案 转染细胞未在含有丙酮酸钠的培养基中培养转染后一天，去除含有 DNA-脂质体复合物的培养基，更换为含有丙酮酸钠的培养基。丙酮酸钠为细胞提供额外的能量来源。 病毒上清液采集过早通常可在转染后 48–72 小时采集病毒上清液。如果此时仍有许多细胞附着在培养板上且外观健康，则再等待24小时，再收获病毒上清液。病毒上清液过稀浓缩病毒（Yee，1999）。 病毒上清液冻融多次请勿冻融病毒上清液超过3次。滴度测定细胞系选择不当使用 HT1080 细胞或其他贴壁细胞系返回顶部 生成慢病毒储备液（续） 问题原因解决方案病毒滴度低（续） 目标基因对细胞有毒性请勿生成含有活化癌基因或有害基因的构建体。 目标基因较大病毒滴度通常随着插入片段大小的增加而下降。如果滴度较低，则浓缩病毒。不建议插入大于 5.6 kb 的片段。 转导过程中未加入聚凝胺在存在 Polybrene 的情况下，将慢病毒构建体转导至细胞中。Lipofectamine 2000 处理不当在 4°C 下储存。请勿冷冻。轻轻倒置混匀。请勿涡旋。滴度测定时 未获得集落筛选时使用的抗生素过多通过进行杀灭曲线实验确定您的细胞系的抗生素敏感性，并使用杀灭您的未转导细胞系所需的最低浓度。病毒储备液储存不当分装并在 –80°C 下储存。请勿冻融超过3次。 转导过程中未加入聚凝胺在存在 Polybrene 的情况下，将慢病毒构建体转导至细胞中。滴度无法确定； 细胞汇合筛选时使用的抗生素过少增加抗生素用量。 对汇合的细胞执行 Zeocin 筛选在加入选择性培养基之前，用胰蛋白酶消化转导的细胞并重新铺于更大的组织培养板中。 病毒上清液未充分稀释使用范围更广的10倍系列稀释液（例如 10-2 至 10-8）测定慢病毒滴度。返回顶部下表列出了一些潜在的问题和可能的解决方案，可以帮助您解决转导和表达实验中的问题。 转导哺乳动物细胞 问题原因解决方案未表达目标基因 启动子沉默慢病毒构建体可能整合到了可沉默 CMV 启动子的染色体区域中。筛选多个抗生素耐药克隆，并筛选出表达水平最高的克隆。使用 pLenti6/UbC/V5-DEST 生成所含的细胞启动子不受沉默影响的慢病毒构建体 病毒储备液储存不当分装并在 –80°C 下储存。请勿冻融超过3次。 目标基因表达不良转导效率低：转导过程中未加入聚凝胺使用了非分裂细胞类型在存在聚凝胺的情况下，将慢病毒构建体转导至细胞中。使用更高的 MOI，将您的慢病毒构建体转导至细胞中。MOI 过低使用更高的 MOI，将您的慢病毒构建体转导至细胞中。筛选时使用的抗生素过多通过绘制杀灭曲线确定细胞系的抗生素敏感性。使用杀灭您的未转导细胞系所需的最低抗生素浓度。转导后过早收获细胞转导后至少 48–72 小时才能收获细胞，以使表达的蛋白在转导细胞中蓄积。 目标基因对细胞有毒性不建议生成含有活化癌基因或潜在有害基因的构建体。转导后观察到细胞毒性效应用于转导的病毒上清液量过大去除“用过”的含病毒培养基，并更换为新鲜的完全培养基。浓缩病毒（Yee，1999）。 转导期间使用了聚凝胺 (Polybrene®)验证细胞对聚凝胺 (Polybrene®) 的敏感性。如果细胞对聚凝胺敏感，则在转导过程不要使用该试剂。 筛选时使用的抗生素过多通过绘制杀灭曲线，确定细胞系的抗生素敏感性。使用杀灭未转导细胞系所需的最低抗生素浓度。 目标基因对细胞有毒性尝试其他细胞系。返回顶部 参考文献 Andersson, S., Davis, D. L., Dahlbäck, H., Jörnvall, H., and Russell, D. W. (1989) Cloning, Structure, and Expression of the Mitochondrial Cytochrome P-450 Sterol 26-Hydroxylase, a Bile Acid Biosynthetic Enzyme.J. Biol.Chem.264, 8222-8229 Boshart, M., Weber, F., Jahn, G., Dorsch-Häsler, K., Fleckenstein, B., and Schaffner, W. (1985) A Very Strong Enhancer is Located Upstream of an Immediate Early Gene of Human Cytomegalovirus.Cell 41, 521-530 Buchschacher, G. L., Jr., and Wong-Staal, F. (2000) Development of Lentiviral Vectors for Gene Therapy for Human Diseases.Blood 95, 2499-2504 Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., and Yee, J.-K. (1993) Vesicular Stomatitis Virus G Glycoprotein Pseudotyped Retroviral Vectors: Concentration to a Very High Titer and Efficient Gene Transfer into Mammalian and Nonmammalian Cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90, 8033-8037 Calmels, T., Parriche, M., Burand, H., and Tiraby, G. 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