一、方法摸索与优化

目标优化梯度条件，确定分析波长。

1、样品溶剂选择；

2、滤膜吸附试验；

3、DAD检测器下，波长选择主成分最大吸收或平台处。

4、分离条件选择；

5、色谱柱对比；（根据情况酌定）

6、DAD检测器下，水、1mol/l酸、碱、氧（10%双氧水）、光照、高温破坏，各起始物料，中间体，辅料（制剂研究时需同时进行空白辅料破坏）等成分分离。

二、方法摸索优化一般技术要点

1、一般在无参考标准或标准的方法无法直接套用时,需进行此项研究内容，如3类药。

2、样品溶剂：对样品有很好的溶解能力，实验室自然放置稳定存放12小时以上，与流动相有良好的互溶效果。

3、续滤液峰面积达稳定最大值，续滤液体积在5ml以下时较为适宜，否则需要重新筛选溶剂。

4、破坏程度10%左右（5%—15%）为宜，2mol/l酸或碱90℃水浴12小时无破坏即视为样品稳定，不必再追求降解度。4500lx光照48小时，样品粉末及溶液需要同时做。破坏后的样品溶液及空白溶剂均需调整至流动相pH方可进样，可避免对色谱柱产生不良影响。如果破坏超过20%，需要降低破坏条件。

5、分离度良好，测定无干扰，各峰峰纯度符合单峰要求。

6、梯度变化要有最高洗脱能力过程，目的证明所有的杂质成分均能够被洗脱检测。

7、方法摸索优化实验一般是不上资料的，只是体现在实验记录本中，除非是没有方法依据时，如3类药申报时，梯度选择及波长选择等均需要在资料中体现。

8、方法优化完成后，最后在同一天同一人，用同一台机器，对所有样品进行分析测定，具有可比性。

9、方法摸索优化实验采用工艺已经确定的实验室小试、实验室放大样品进行，前期用于原料合成样品配合检测时，可以采用大范围的梯度洗脱进行模糊检测分析。

三、方法学验证项目

（一）专属性

目的：为了验证方法对目标成分检测的区分能力及全面的杂质分析评价。DAD检测器或适宜的通用型检测器下，水、1mol/l酸、碱、氧（10%双氧水）、光照、高温破坏，各起始物料，中间体，辅料，各杂质对照品等在同一天进行分析，可以作为申报资料中杂质谱的论述内容。

一般技术要点

1、参照上述过程进行破坏样品制备，空白及阴性样品都要做。

2、分离度良好，测定无干扰，各峰峰纯度符合单峰要求。

3、梯度要有最高洗脱能力过程。

4、以前期确定的分析条件及方法，在同一天同一人，用同一台机器，对所有样品进行分析测定，具有可比性。

5、本部分数据进资料，最佳采用生产线验证的第1批样品进行。当色谱条件与有关物质检查方法相同时，专属性实验数据可以共用。出图时主成分峰的紫外光谱图及峰纯度图均要出图。

（二）检测限

信噪比法，S/N≥3倍时的浓度为检测限。

一般技术要点

先进空白，再进对照品浓溶液（1mg/ml），在主峰相同位置处选择空白溶剂1—2min范围的基线积分得出峰高，按照峰高的3倍计算样品浓度，直接用浓溶液稀释至目标浓度附近即可，资料中体现至少3张图（空白溶剂、浓溶液、及稀释液）。

（三）定量限

信噪比法，S/N≥10倍时的浓度为定量限。 

一般技术要点

按照基线峰高的10倍计算样品浓度，直接用检测限浓溶液稀释至目标浓度附近即可，连续进样6针，计算峰面积RSD0.999。采用对照品进行。线性范围一定要将回收率试验的最高浓度包含进去，否则回收率浓度超过线性范围，缺乏定量依据，这个错误非常常见。

（五）精密度

同一份供试品（样品）溶液，连续进6次。 

一般技术要点

计算峰面积RSD