编译：微科盟HushKuo，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

导读  

稳定的亚硝化是市政污水中快速脱氮的主要挑战。本文展示了在处理生活污水的强化生物除磷（EBPR）反应器中部分硝化（PN）的快速实现。聚磷酸盐积累生物（PAOs）在短期好氧HRT（2.0h）和SRT（10d）下富集，除磷效率令人满意（95.9%）。氨氧化细菌（AOB）和亚硝酸盐氧化细菌（NOB）同时被筛除。有趣的是，通过随后延长好氧HRT和SRT，AOB恢复得比NOB快得多，导致PN在15天内迅速建立。AOB的氨氧化率显著增加了44.2%，产生了95.8%的高亚硝酸盐积累率（NAR）。属于PAO的Tetrasphaera、嗜盐单胞菌属Halomonas、副球菌属Paracoccus和Candidatus_Accumulibacter占4.6%。异养菌的增殖，尤其是PAO，通过有利于AOB活性和与功能性细菌的协同作用，使微生物与NOB的竞争力最大化。

图文摘要    

论文ID

原名：Rapidly achieving partial nitrification of municipal wastewater in enhanced biological phosphorus removal (EBPR) reactor: effect of heterotrophs proliferation and microbial interactions

译名：强化生物除磷（EBPR）反应器中快速实现市政污水的部分硝化：异养菌增殖和微生物相互作用的影响

期刊：Bioresource Technology

通讯作者：彭永臻

通讯作者单位：北京工业大学城镇污水深度处理与资源化利用技术国家工程实验室

DOI号：10.1016/j.biortech.2021.125712

实验设计

图1 示意图（a）和不同阶段的运行模式（b）。       表1 系统的不同运行模式。  

表2 实际市政污水的主要水质特征。

引言

由于过量的氮磷排放会导致水环境富营养化和退化，节能型营养元素去除生物技术的开发成为污水处理厂的迫切需求。然而，将硝化和反硝化相结合的传统方法通过氨氧化细菌（AOB）对铵（NH4+-N）氧化为亚硝酸盐（NO2--N），通过亚硝酸盐氧化细菌（NOB）进一步氧化硝酸盐（NO3--N）的过程需要相当大的能量消耗。此外，脱氮除磷和的厌氧和缺氧工艺需要外部碳源，不仅增加了运营成本，还诱发二次污染。因此，寻求有效的解决方案，提高实际运行中的脱氮性能，具有十分重要的意义。

短程硝化脱氮是城市污水的节能处理技术。在此过程中，NH4+-N被氧化为 NO2--N，然后通过反硝化或厌氧氨氧化菌直接还原到N2，可节省60%的曝气耗能和100%的有机碳需求。然而，由于有效抑制NOB仍然是城市污水处理工程应用的主要瓶颈，稳定高NO2--N积累是实际中实现部分硝化的关键问题。为了防止NO2--N通过抑制NOB进一步氧化，学界根据微生物的代谢动力学的差异提出了几种策略，如低溶解氧（DO）、短污泥保留时间（SRT）和高温等。通过添加NH2OH、游离氨（FA）和游离亚硝酸（FNA），可以引入NOB的外部抑制。此外，厌氧/有氧间歇曝气等运行策略也被应用于PN的启动中。虽然这些方法在实验室中已得到广泛报道，但PN在城市废水中的大规模工程应用至今尚未实现。它仍然面临着在NH4+-N浓度（30-60 mg N/L）、低温（低于30°C）、氮通量和负荷频繁波动下对NOB抑制不足等主要挑战。当前迫切需要有效的快速启动和稳定控制PN的战略。

另一方面，添加化学剂去除磷的方法不仅会增加运营成本，对含有化学沉淀物的大量污泥的进一步处理容易造成严重二次环境问题。相比之下，生物除磷已成为污水处理厂在环境保护方面良好选择。在此过程中，PAO在厌氧条件下通过水解和利用聚磷酸盐在细胞中产生能量，同时利用挥发性脂肪酸（VFA）和合成聚β-羟基烷酸盐（PHA）等内源性碳源，并伴随着磷酸盐释放到液体相中。随后，PAO分解储存在细胞中的内部碳源（主要是PHA），在有氧阶段产生能量，用于微生物的生长以及细胞外PO43--P的逆浓度吸收和聚磷酸盐的再合成和糖原的合成。

关于PO43--P去除，通常需要较短的SRT来排放富含磷的污泥。然而，作为自营养细菌，AOB和NOB的增长率相对较低，需要较长的SRT，这是城市污水处理中同时进行PO43--P去除和部分硝化的主要矛盾瓶颈。

在这项研究中，在富集PAO的EBPR中研究了一种新的策略用于启动和稳定运行部分硝化并实现实际生活污水的PO43--P去除。研究探讨了异养细菌（即PAOs）增殖对亚硝酸盐化的潜在影响；评估了有氧时间和SRT等关键控制参数的综合效果；根据微生物群落结构分析了功能细菌之间的微生物相互作用，包括PAO与AOB、AOB和NOB之间的竞争。

结果与讨论

1 EBPR系统除磷性能

本研究探讨了在单级SBR中结合部分硝化作用的长期PO43--P去除。根据不同的操作条件分为四个阶段。SBR在A/O模式下运行。反应循环中的曝气阶段设置为1.0h，SRT保持在10天，以富集PAO和构建EBPR。

在第I阶段，观察到逐渐增加的PO43--P释放和吸收活性，表明PAO的有效回收。接种两天后，在厌氧阶段结束时检测到高水平的PO43--P释放，高达22.6 mg/L，随后在好氧阶段结束时有足够的PO43--P吸收能力，达到20.60 mg/L。在后续的运行中进一步加强。进水平均PO43--P浓度为5.73 mg/L，平均PO43--P释放量高达30.87 mg/L。出水平均PO43--P低至0.66 mg/L，即获得了足够的PO43--P去除性能，对应的平均PO43--P去除效率为91.3%（图2b）。

值得注意的是，第II阶段的平均磷酸盐去除率增加到95.9%。经过50天的运行，PAOs对内部有机碳源的平均储存效率高于80%（图2c）。从图2可以看出，在含碳量有限的生活污水中成功构建了EBPR系统。然而，观察到出水TIN 随进水变化很小，在好氧阶段NH4+-N的平均降解小于3 mg/L（图2b）。表明短曝气阶段和短SRT（10天）对AOB和NOB的抑制和筛除。

图2 EBPR和PN系统的长期性能。（a）氮（NH4+-N、NO2--N和NO3--N）和NAR的变化；（b）PO43--P浓度和去除效率的变化；（c）COD和去除效率的变化。 2 通过异养细菌对NOB的抑制胁迫快速建立部分硝化作用

从第III阶段开始，好氧时间从1.0h逐渐延长到3.0h，以便在EBPR 系统中进行硝化作用。通常，在实际生活污水中有机物存在的情况下，异养细菌将比自养细菌具有更高的活性。正如本研究所预期的那样，在有氧阶段PAOs吸收PO43--P完成后，才可以检测到自养细菌驱动的硝化反应。有趣的是，根据在随后的运行期间当氧气可用于AOB时，NAR迅速增加到90%的高水平，能一直观察到明显的NO2--N积累（图2a）。

本研究还注意到同步硝化/反硝化（SND）发生在曝气阶段。据报道，在低溶解氧条件下，SND是脱氮的主要途径。在这项研究中，拟认为SND过程的发生是有效部分硝化过程的关键原因。因为异养细菌先前在I和II阶段富集，AOB在NH4+-N氧化中产生的NO2--N更倾向于被反硝化细菌而不是NOB消耗，这导致对NOB的选择性抑制压力。此外，NO2--N还原所需的COD/TIN比NO3--N少，由于部分硝化，导致SND对NO2--N还原的性能增强。这与之前的研究一致，即SND可以随着COD/TIN的增加而有效地提升。

此外，在好氧阶段结束时有NH4+-N残留，这也有利于提高AOB和NOB竞争的能力。然而，随着部分硝化作用发展，多余的NO2--N在下一个循环的厌氧阶段被反硝化，与PAOs竞争原废水的碳源。在这种情况下，PAOs储存的内部碳源减少，进而导致PO43--P的释放和吸收减少。在第54天，PO43--P去除效率降低到75%（图2c）。建议通过延长好氧时间来提高内部碳源的利用将有利于PAOs吸收PO43--P。此外，适当提高曝气率也可以达到同样的效果。另一方面，在好氧阶段引入厌氧氨氧化脱氮可能是通过减少厌氧阶段反硝化细菌碳消耗的潜在解决方案。

在随后的运行中，NAR稳定地保持在较高水平，说明AOB在好氧阶段的争氧能力增强。好氧阶段结束时NH4+-N从40.26 mg/L（第60天）下降到12.58 mg/L（第100天），与出水NO2--N从10.99 mg/L增加到24.36 mg/L一致。NAR稳定保持在95%以上，NO3--N残留量小于1 mg/L（图2a）。这是为了随后将合适比例的NH4+-N与NO2--N偶联。

该研究表明，AOB的选择性恢复和增强可作为实现部分硝化的重要参数。来自异养细菌的抑制应激在抑制和筛出NOB中起关键作用。

3 促进部分硝化作用的功能菌之间的竞争机制

厌氧和曝气阶段氮、PO43--P和COD的变化表明EBPR系统中PN过程的快速实现和稳定运行（图3）。可以看出，在厌氧阶段结束时，PO43--P释放量为19.17 mg/L，随后吸收量为18.77 mg/L，导致出水PO43--P低至0.4 mg/L。因此，EBPR系统具有出色的磷转化活性，其令人满意的PO43--P吸收速率为9.52 mg P/gVSS/h，高于先前报道的6.7 mg P/gVSS/h。同时，在整个好氧阶段几乎没有观察到硝化作用。在好氧阶段结束时有67.86 mg/L的NH4+-N残留，这与流出物中几乎检测不到的NO2--N和NO3--N一致（图3a）。这清楚地表明PAOs表现出高活性，而AOB和NOB由于短的曝气反应和低SRT而被完全抑制。

此外，在厌氧阶段，随着内部碳源储存量的增加，PO43--P的释放能力得到增强。在第III阶段，观察到40.16 mg/L的高碳储存，PO43--P释放增加到27.15 mg/L，可归因于PAO的富集。随着好氧时间延长至2.0 h，PO43--P在第1h内被完全去除，PO43--P吸收率增加至12.99 mg P/gVSS/h。随后，NH4+-N被氧化为 NO2--N，其活性从1.32 mg N/gVSS/h显著增加到1.67 mg N/gVSS/h。NO2--N产量达到3.52 mg/L，NO3--N残留非常有限，导致NAR高达83.7%（图3b）。这清楚地表明，在富含PAO的培养物中，AOB能够比NOB更快地响应和恢复。

随着好氧时间延长至3.0 h，SRT延长至15 d，AOB和NOB都有更多机会与PAO竞争DO。可以看出PO43--P吸收主要在好氧阶段的第一个小时进行，说明PAOs比自养细菌具有更强的争氧能力。PO43--P吸收反应完成后部分硝化活性增加，表明AOB（而不是NOB）可能需要额外的氧气。

当有氧时间延长至3.0 h时，观察到AOB活性进一步提高。NH4+-N氧化速率增加到2.76 mg N/gVSS/h，对应NO2--N生成速率增加到1.62 mg N/gVSS/h。值得注意的是，PO43--P的吸收和NH4+-N的氧化反应同时进行。然而，在好氧阶段的第一个小时，PO43--P的吸收量下降到11.99 mg/L，PO43--P的吸收速率下降到6.74 mg P/gVSS/h（图3c）。但对厌氧阶段的有机碳储存能力和PO43--P释放影响不大。这主要是由于AOB和PAO之间对O2的竞争。

此外，在好氧阶段，随着NH4+-N氧化速率进一步增加到3.98 mg N/gVSS/h，NO2--N产生速率增加到4.19 mg N/gVSS/h，AOB竞争O2的能力变得更加强大。结果，当出水NO2--N浓度达到18.07 mg/L以及NO3--N浓度低至0.34 mg/L时，实现了理想的PN性能。值得注意的是，研究实现了96.5%的高NAR水平（图3c），这远高于先前研究中处理实际生活污水的短程脱氮系统的效果。

需要说明的是，部分硝化主要在PO43--P吸收完成后进行，NH4+-N氧化速率显著增加，NOB活性的抑制水平远低于AOB。这表明PAOs、AOB和NOB之间的氧竞争促进了NH4+-N氧化为NO2--N而没有进一步氧化为NO3--N的选择性增强，该条件较为有利且确保了稳定的PN过程。

图3 在（a）第37天、（b）57天和（c）91天的典型循环期间，氮（NH4+-N、NO2--N和NO3--N）、PO43--P、COD的变化。

  4 好氧时间和污泥停留时间对最大AOB和PAOs活性的影响

AOB和NOB的活性与部分硝化过程的稳定性密切相关，研究在系统运行的不同阶段进行了分析和测定。图4显示了AOB和NOB最大活性的变化。

在启动阶段，AOB和NOB的活性相当，但均处于较低水平，分别为1.23和1.18 mg N/gVSS/h，而PAOs的活性较高，为8.81mg P/gVSS/h。正如预期的那样，在1.0 h短曝气阶段的长期运行中，PAOs得到了有效的富集，有利于PO43--P的吸收活性上升到9.73 mg P/gVSS/h。在此条件下，AOB和NOB的活性分别下降到1.05 mg N/gVSS/h和0.18 mg N/gVSS/h的低水平。这表明将好氧时间作为关键参数进行控制时，在PO43--P吸收阶段结束时PAOs得到了富集和增殖。此外，SRT是本研究中功能细菌富集的另一个关键因素。通过应用污泥排放策略，获得了令人满意的PO43--P去除效率95.9%，同时在EBPR中筛除了AOB和NOB。

随着好氧时间的逐渐延长，系统开始进行部分硝化反应。PAO仍保持令人满意的活性，为8.72 mg P/gVSS/h。同时，AOB的活性增加到2.16 mg N/gVSS/h，而NOB的活性降低到0.15 mg N/gVSS/h（图4）。特别是当PAOs完成好氧段过量的PO43--P吸收反应时，NH4+-N转化为NO2--N的活性增加，说明厌氧-好氧交替运行模式有利于EBPR系统中PAOs和AOB的富集。

当有氧时间稳定地延长到3.0h时，好氧时间的调整对AOB增强和NOB抑制的关键影响得到了很好的证明。AOB的活性大幅增加至9.55 mg N/gVSS/h，远远超过NOB（0.48 mg N/gVSS/h）（图4）。这是稳定部分硝化的关键原因。相反，PAOs的活性降低到3.84 mg P/gVSS/h，主要与AOB活性迅速增加导致AOB竞争O2有关。此外，适当的曝气时间有利于对NOB的有效抑制。

图4 （a）AOB、NOB和PAO活性以及（b）系统的MLSS、MLVSS和SRT的变化。

  5 功能菌的富集 5.1 功能菌的丰度

qPCR结果表明，初始阶段PAOs的丰度为3.15×108 copies/g干污泥（图5a），AOB的丰度低于NOB（包括硝化杆菌属Nitrobacter和硝化螺旋菌Nitrospira）。当反应器在A/O模式下运行20天时，PAO的丰度增加到 9.79×108 copies/g干污泥。此时，AOB和NOB丰度均下降。结果表明，尽管生活污水中的COD浓度较低，但PAOs作为异养细菌具有较高的增殖率和快速富集能力，并具有令人满意的细胞内有机碳储存能力。随着反应器的运行，与初始接种相比，PAOs丰度进一步增加了7.5倍，达到2.67×109 copies/g干污泥。PAO的这种有效富集确保了EBPR系统中大量的PO43--P去除（见图6）。

值得注意的是，AOB丰度下降了71.1%，其中Nitrobacter和Nitrospira丰度下降幅度更大，分别为86.1%和80.9%。此外，通过污泥排放策略控制污泥龄为10天，AOB和NOB同时筛除。此外，PAOs在好氧阶段可以优先使用 O2，而AOB和NOB作为自养细菌，由于在停止曝气时间时无法获得O2而活性较低。

第70天AOB丰度增加21.7%至4.88×106 copies/g干污泥，而PAOs丰度较第45天下降92.1%（图5a）。同时，随着好氧时间延长，部分硝化作用迅速发展，硝化细菌丰度持续下降，Nitrospira丰度略有增加。因此，AOB可以在好氧阶段与PAO竞争，将NH4+-N转化为NO2--N，而氧用于PAO对过量PO43--P的吸收减少，丰度降低。重要的是，停止曝气时间在该系统中对抑制NOB活性具有重要作用。Nitrobacter的减少很好地说明了这一点，但对Nitrospira的抑制作用不明显。这与Wett等人（2013）和Liu等人（2013）报道的结果一致。他们发现在长期缺氧条件下，Nitrobacte的丰度显著低于Nitrospira，这意味着溶解氧较低更有利于Nitrospira生长。

图5 不同阶段的（a）细菌丰度和（b）第100天的微生物群落变化。

图6 实现部分硝化的机理图。

  5.2 部分硝化作用中细菌种群的演替

本研究采用16S rRNA扩增子测序揭示微生物群落演替，以更好地理解部分硝化作用的微生物机制。在稳定阶段的第100天收集污泥样品。主要群落在门和属水平的分布如图5b所示。

该系统共检测到22个门，其中在接种污泥中比例最大的是变形菌门Proteobacteria，相对丰度为45.4%（图5b）。Proteobacteria是污水处理厂和反硝化系统中常见的优势门，已被证明可以去除氮和可降解有机物。此外，系统中绿弯菌门Chloroflexi的比例为15.6%。该群落组成为活性污泥提供了稳定的框架，有利于污染物的去除。

在属水平上，PAOs在系统中富集，包括Tetrasphaera、Halomonas、Paracoccus和Candidatus_Accumulibacter，总相对丰度为4.6%（图5b），这可能在高PO43--P去除效率方面发挥重要作用。一般认为异养细菌（如PAO）的增殖速率更大，提供了在好氧阶段与硝化细菌竞争氧气的关键能力。

另一方面，检测到属于AOB的亚硝化单胞菌属Nitrosomonas丰度为0.005%。同时，被确定为主要NOB的Ca. Nitrotoga在系统中的丰度为0.088%。尽管Nitrosomonas的丰度低于Ca. Nitrotoga的丰度，系统的部分硝化作用仍能保持稳定。推测活性较大的AOB在溶解氧不足的条件下，在好氧阶段可以优先利用O2进行部分硝化。此外，适时停止曝气时间策略可有效抑制NOB活性，维持部分硝化作用稳定运行。此外，系统中还检测到异养反硝化细菌（Ottowia、热单胞菌属Thermomonas、红细菌属Rhodobacter、Thaurea、腐螺旋菌科Saprospiraceae），丰度高达12.3%（图5b），促进了反硝化阶段的脱氮和有机物的降解。这些证明了功能菌协同同时去除了实际生活污水中的氮、PO43--P和有机物。

  6 本研究在主流污水处理厂中的应用

迄今为止，在不添加外部碳源和化学除磷试剂的情况下，取得从碳源受限的市政污水中去除氮和PO43--P的理想效果仍然是一个主要挑战。短程脱氮和厌氧氨氧化技术提供了一种具有成本效益的解决方案，而这两者都面临着难以实现PN工艺稳定运行的瓶颈。为了解决该问题，有学者提出了污泥发酵产物作为外部碳源分别实现了82.9%和97%的TIN去除率，两项研究中PO43--P去除率为96%。然而，额外的NH4+-N和PO43--P的引入会使微生物群落有所不同。

本研究有效抑制了NOB的活性，NAR高达95%，为后续耦合厌氧氨氧化奠定了良好的基础。整个反应过程不需要外部碳源，好氧阶段的成本和能耗将大大降低。此外，利用PAOs等异养菌增殖速度快的特点，结合好氧时间和SRT的调节，可以快速建立部分硝化作用。这项研究的启动时间很快，不需要额外的化学试剂且无副产品影响。研究提出了一种成本效益高、控制简单、运行稳定的替代方案，是在主流废水处理中同步脱氮除磷、曝气和碳足迹低、效率高且具有广阔前景的解决方案。

结论

EBPR是针对生活污水开发的，PO43--P去除效率高达95.9%。AOB和NOB在短HRT和SRT下同时筛出。在EBPR系统中，部分硝化在15天内迅速启动，并保持了95.8%的高NAR。AOB显示出比NOB更快的恢复，在最佳有氧时间和SRT下，AOB的最大活性为9.55 mg N/gVSS/h。PAOs在系统中富集，总相对丰度为4.6%。异养菌、PAOs、AOB和NOB之间的竞争对部分硝化的启动和稳定运行起到了至关重要的作用。