自噬形态学特征

通过超微结构而鉴定的自噬的形态学特征表现在如下几个方面：

1) 高尔基体和内质网等细胞器膨胀 2) 胞质无定形，核碎断、固缩 3) 形成大量吞噬泡(由粗面内质网包围将要被吞噬的底物，随后与初级溶酶体结合形成) 4) 细胞质膜失去特化，可能发生细胞膜出泡现象

图1：自噬与正常细胞以及其他死亡形式细胞形态学比较。（a）正常细胞，（b）自噬细胞，（c）凋亡细胞，（d）坏死细胞

自噬其他特征

1) 细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。 2) 自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。 3) 自噬的可诱导特性,表现在2个方面: 第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。 第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。 4) 批量降解，这是与蛋白酶体降解途径的显著区别。 5) “捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。 6) 自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来。

自噬通路概述

自噬的整个过程中, 时刻都受到不同的自噬相关基因(autophagy-related gene, ATG)的调控, 大约已有38个自噬相关基因被发现，这些基因在酵母和哺乳动物高度保守[2, 6]。典型的自噬（主要是巨自噬）过程如图3所示，是由ULK1激酶复合体（它由ULK1、ULK2、 ATG13、 FIP200和ATG101组成）起始，并接收来自mTOR复合体1（mTORC1）的应激信号。当mTORC1的激酶活性被抑制，自噬体形成过程开始发生[7, 8]。这涉及VPS34与AMBRA1、BIF-1和Bcl-2相互作用后，进而与Beclin 1形成一个复合体。VPS34的结合是至关重要的，因为其脂质激酶活性是自噬体形成所必需的[9]。目前的研究表明，ULK1对Beclin 1的磷酸化引发了含VPS34的ATG14L复合体的活性，促进了自噬的诱导[10]。自噬体形成也需要ATG12和LC3，以及类似于泛素连接酶系统的蛋白偶联系统。LC3系统对自噬体的运输和成熟是非常重要的[11]，一旦自噬体已经成熟，它将与溶酶体外膜发生融合并降解其运输的内容物。

图2：自噬信号通路及关键参与蛋白

细胞自噬检测解决方案

1.自噬检测常用KO细胞模型产品

细胞自噬过程中，经常会用到一些KO细胞模型，ABclonal为了方便大家进行机制研究，提供自噬核心靶点KO细胞模型产品（图4），同时ABclonal也可提供CRISPR/Cas9基因敲除服务。

图3：自噬核心靶点KO细胞模型（节选）

2.自噬检测常用方法

➤方法一：文献最常用的自噬检测方法是蛋白印迹检测自噬标志物(Autophagy Marker)LC3的转换（LC3-II/LC3-I）以及荧光显微镜检测LC3点状聚集物的形成。

自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为自噬体膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。目前大部分LC3抗体选择的抗原位于N端，PE基团的加入可能会使得N端蛋白构象变化，导致抗体对LC3的亲和力增强，所以LC3-II条带深并不能代表该样本处于高自噬状态。另外，LC3-I对冻融比较敏感，容易在SDS上样缓冲液降解。所以在做半定量检测时，除了使用LC3-II/LC3-I的比值外，也可以配合使用LC3-II与管家蛋白的比值进行半定量。由于LC3是脂化和膜相关蛋白，在细胞裂解时，可在冰上短暂超声，以促进蛋白溶解，使得LC3顺利从膜上解离。此外LC3-I的分子量约16KD，LC3-II在电泳后停留在14KD处，LC3-I和LC3-II均为小分子量蛋白，且差距仅2KD，所以在WB时要注意使用高浓度分离胶进行分离（建议约15%），转膜时使用小孔径0.2μm的 NC膜，采用恒流200mA，转膜40min即可。

（Note：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法1和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）

A19665 [KO Validated] LC3B Rabbit mAb

自噬发生时，p62与LC3蛋白可发生荧光共定位，并且，在Co-IP中发生蛋白共沉淀且细胞质中蛋白会被不断降解;而当自噬活性减弱或者自噬系统受损时，p62蛋白会在细胞质中不断积累，因而p62也是反映自噬活性的重要标记蛋白之一，其蛋白含量间接反映自噬小体清除水平，与自噬流呈负相关。

A19700 [KO Validated] SQSTM1 / p62 Rabbit mAb

➤方法二：利用激光共聚焦显微镜检测自噬体与其他细胞器的融合

在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：

Hsp60：定位于线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。

A0564 Hsp60 Rabbit mAb

Calreticulin（钙网织蛋白，CALR）：内质网腔。

A1066 CALR Rabbit pAb

Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。 pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。

➤方法三：荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成

由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

➤方法四：观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV）

3.自噬的上游调节通路和关键蛋白

图4：自噬相关通路

4.自噬常用的激活剂和抑制剂

正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：

（一）自噬诱导剂

1）药物诱导 2）其他模型，如感染、DNA损伤、缺氧、H2O2等。

图5：自噬诱导类药物

（二）自噬抑制剂

1）药物诱导 2）其他方法，如利用突变株、反义RNA干扰技术（Knockdown）、基因缺失技术、外源基因导入等。

图6: 自噬抑制类药物

>>>>文献参考

1.Mizushima, N., et.al (2008). Nature 451, 1069-1075. 2.Nakatogawa, H.,et.al (2009). Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 458-467. 3.Xie, Z. and Klionsky, D. J. (2007). Nat. Cell Biol. 9, 1102-1109. 4.Levine B, Klionsky DJ. Dev. Cell 2004;6:463. 5.Klionsky, DJ., editor. Autophagy. Landes Bioscience; Georgetown, TX: 2004. p. 1-303. 6.Tsukada, M. and Ohsumi, Y. (1993). FEBS Lett. 333,169-174. 7.Jung CH, et al. (2009). Mol Biol Cell 20:1992-2003. 8.Mizushima N (2010). Curr Opin Cell Biol 22: 132-139. 9.Pattingre S, et.al (2008). Biochimie 90: 313-323. 10.Russell,RC. et al. (2013). Nat Cell Biol. 15: 741-750. 11.Matsushita M, et.al (2007). J Biol Chem 282: 6763-6772.