心肌缺血-再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI）是心血管疾病主要的死亡原因[1-2]。心肌缺血导致的心肌细胞死亡，以往一直认为是坏死，近年研究表明细胞凋亡参与MI/RI病理过程。细胞凋亡是有机体维持体内平衡的重要机制，过度凋亡既是MI/RI的结果，又是导致进一步心脏损伤的重要环节[3-4]。因此，抑制细胞凋亡是预防心肌细胞死亡的重要手段，也是抗MI/RI新药研发的重要靶点。趋化因子是机体内一群能使白细胞发生趋化运动的小分子细胞因子，其中的C-C趋化因子主要趋化和激活单核细胞和某些T细胞亚群，与炎症和免疫反应密切相关。趋化因子C-C基序配体6(C-C motif ligand 6，CCL6)是巨噬细胞和T细胞表达的一种重要的C-C型趋化因子，通过和受体CCR6结合可以募集巨噬细胞、T细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞参与机体免疫调节[5]。研究表明，CCL6和多种疾病存在密切关联，包括慢性腹膜炎、皮肤损伤、肺纤维化等[6-7]。目前，CCL6在缺血性心肌损伤中的作用还不清楚。本研究拟通过比对正常心肌和缺血-再灌注损伤心肌样本间基因表达，筛选并分析差异基因在心肌细胞损伤中的作用和分子机制，本研究将有助于解释心肌细胞缺血损伤的发生机制和潜在治疗靶点。

DMEM高糖培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Giboco公司。MTT细胞增殖检测试剂盒和ELISA试剂盒购于中国南京凯基公司。Annex V/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购于美国BD公司。荧光定量PCR检测试剂盒购于日本宝生物公司。其他生化试剂均为进口分装或者国产分析纯。

MI/RI大鼠心肌细胞表达芯片GSE4105都由GEO数据库(GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获得。利用R/Bioconductor软件(https://www.bioconductor.org/)对数据进行归一化处理并分析差异基因。

H9C2心肌细胞购于由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库，培养于含有10%胎牛血清的培养液中，培养条件为37℃、5%CO2。

当细胞融合度达到80%时进行OGD处理，弃原有培养基，加入PBS清洗细胞三次。然后将细胞置于低糖培养基、37℃缺氧环境培养，N2:CO2:O2比例分别为94%:5%:1%。

使用ELISA检测试剂盒(USCNLIFE, 武汉, China)，根据厂家的标准步骤，检测细胞培养上清中CCL6含量。

采用TRIzol法提取各组细胞的总RNA，逆转录得到总cDNA，进行荧光定量PCR检测目的基因表达。IGF2-AS的正向引物为5’- CGCCACTGTGTTACCATT - 3’，反向引物为5’- TTGCCCATCCCAGATAGAA；细胞内参GAPDH正向引物为5’- CACCATCTTCCAGGAGCGAG - 3’，反向引物为5’- TCACGCCACAGTTTCCCGGA - 3’。PCR反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，重复40个循环。目的基因相对表达量根据2-ΔΔCt公式计算。

通过Trizol法提取心肌细胞总RNA，逆转录为cDNA，采用美国Arraystar公司高通量lncRNA芯片，在标准条件下将标记好的探针和高密度基因组芯片进行杂交，采用芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，对不同组别中lncRNA表达水平进行差异性分析。

取生长良好的H9C2细胞，加入细胞裂解液，置于冰上放置30 min，采用BCA方法检测蛋白浓度。取20 μg蛋白样本，与上样缓冲液混匀后进行沸水浴10 min，蛋白分离采用进行SDS-PAGE电泳。然后在100 V的条件下湿转膜90 min，用5%脱脂牛奶在室温条件下孵育1~2 h。4℃条件下孵育一抗过夜（抗CCL6和抗GAPDH抗体稀释比例分别为1:1 000和1:3 000）。用PBST洗膜，5 min/次，重复3次，然后室温孵育二抗（兔抗1：5 000）2 h。洗膜，5 min/次，重复3次，采用Millipore ECL system进行显影。

所有数据的统计均采用Graphpad prism (Graphpad Software，San Diego，CA)软件进行分析。计量数据结果表示为均数±标准差（Mean±SD），使用独立样本t检验和单因素方差分析（ANOVA）分析组间差异。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

对GSE4105数据集进行分析，热图结果显示CCL6在缺血-再灌注心肌组织中的表达低于正常心肌组织（图 1A）。此外，荧光定量PCR结果显示，缺血-再灌注导致心肌组织中CCL6 mRNA水平显著降低（P < 0.05）（图 1B），这些结果表明CCL6在缺血-再灌注心肌组织中表达水平降低，可能在心肌损伤中发挥一定的作用。

ELISA检测发现OGD处理可以引起细胞培养上清CCL6表达水平下降，且随着处理时间的延长，CCL6下降水平愈加显著（P < 0.01）（图 2A）。进一步收集细胞裂解液，采用荧光定量PCR和免疫印迹检测发现氧葡萄糖剥夺导致CCL6 mRNA和蛋白表达明显降低，而且呈现时间依赖性（图 2B和C）。采用MTT方法检测OGD处理后心肌细胞活力情况，结果发现氧葡萄糖剥夺导致心肌细胞活力下降，且呈现时间依赖性，而添加CCL6重组蛋白可以显著逆转细胞活力的下降（图 3A）。进一步采用流式细胞仪检测OGD处理24 h后心肌细胞凋亡情况。Annex V/PI细胞双染结果显示，氧葡萄糖剥夺促进心肌细胞凋亡率上升，而加入外源性CCL6后，细胞凋亡率呈现下降趋势（图 3B），说明CCL6对OGD诱导的心肌细胞损伤有一定的保护作用。

与DMSO处理组相比，lncRNA表达谱芯片结果显示，CCL6处理组可以影响心肌细胞lncRNA表达变化（图 4A），其中变化最为显著的是IGF2-AS。为了进一步验证IGF2-AS的表达受到CCL6影响，本研究采用荧光定量PCR检测不同剂量CCL6处理H9C2细胞不同时间心肌细胞中IGF2-AS表达变化。结果显示，随着处理时间的延长，IGF2-AS表达呈现逐步下降的趋势（图 4B），而且随着剂量的增加，IGF2-AS的表达水平同样明显减少（图 4C）。

和对照组相比，免疫印迹显示OGD和CCL6处理对心肌细胞中总Akt含量没有明显影响，但OGD导致磷酸化Akt水平下降，而外源性添加CCL6可以增加p-Akt含量。GSK-3β是PI3K/Akt通路的下游信号分子，免疫印迹显示，随着Akt通路活化，磷酸化GSK-3β水平也显著上升（图 5）。不同组别中总Akt和总GSK-3β的表达水平差异无统计学意义（P > 0.05）。

本研究应用GEO公共数据库数据集发现，大鼠缺血-再灌注后心肌组织中CCL6表达水平显著下降。本研究发现氧葡萄糖剥夺可以降低CCL6表达水平和心肌细胞活力，并诱导细胞凋亡，而外源性施加CCL6重组蛋白可以逆转心肌细胞损伤。lncRNA芯片分析显示CCL6可以降低IGF2-AS表达水平、激活Akt/GSK-3β信号通路，从而发挥心肌保护作用。

CCL6属于C-C趋化因子家族，可以由巨噬细胞、T细胞、滑膜成纤维细胞、血小板、管状表皮细胞和一些肿瘤细胞表达。通过和受体CCR6结合，CCL6可以募集巨噬细胞、T细胞、嗜碱性粒细胞到达炎症部位发挥抗炎和抗感染作用[5-7]。目前，CCL6在缺血性心肌损伤中的作用还不清楚。除了募集免疫细胞到达炎症部位，CCL6还可以在背根神经节细胞中发挥抗凋亡作用[8]。本研究中发现，缺血-再灌注大鼠模型心肌细胞中CCL6的表达显著低于假手术组，提示心肌细胞CCL6表达水平降低可能会导致心肌细胞活力降低和凋亡水平增加。为了验证这一设想，我们采用MTT和流式细胞术检测氧葡萄糖剥夺后大鼠心肌细胞CCL6表达、细胞活力和凋亡水平的变化。结果显示，糖氧剥夺可以明显减少CCL6表达水平，降低心肌细胞活力，并促进细胞凋亡，而外源性施加CCL6可以逆转糖氧剥夺诱导的心肌细胞损伤。

LncRNA是一类长度大于200个核苷酸、缺少完整开放阅读框、无蛋白质编码功能的RNA[9]。lncRNA可以通过染色质重塑、基因印记、剪接调控、mRNA降解和翻译调控等多种机制发挥生物学功能，其表达异常和多种人类疾病相关，包括肿瘤、心脑血管疾病和自身免疫性疾病[10-12]。在缺血或内皮表型转换时内皮细胞中lncRNA MALAT1显著升高，干扰其表达后会导致内皮细胞增殖活力和血管新生能力降低[13]。lncRNA H19能够结合到miR-103并促进靶基因FADD表达，从而降低缺血-再灌注动物以及细胞模型中细胞坏死[14]。本研究中采用lncRNA基因筛选出显著受到CCL6调控的lncRNA IGF2-AS。荧光定量PCR结果进一步证实CCL6可以抑制IGF2-AS表达，且呈现时间和剂量依赖性。

Akt也称蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，Akt激活是PI3K信号通路发挥促细胞生存功能的重要前提[15]。Akt可以通过不同底物参与细胞的生理病理过程，目前已经鉴定到50多种Akt底物。糖原合成酶-3（GSK-3）是Akt的重要底物之一，是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，通过对底物蛋白的磷酸化参与糖原合成、基因转录激活、细胞存活与生长、细胞营养代谢、细胞凋亡和细胞周期等过程[16-17]。本研究发现，糖氧剥夺导致心肌细胞中磷酸化Akt和磷酸化GSK-3β水平下降，而外源性添加CCL6可以逆转这一过程，说明CCL6对心肌细胞的保护作用可能是通过Akt/GSK-3β信号通路发挥的。此外，研究报道抑制IGF2-AS表达可以增强神经干细胞抗凋亡能力，进而保护神经干细胞免受麻醉剂诱导神经损伤；进一步研究其机制发现，抑制IGF2-AS可以激活Akt信号通路[18-19]。因此，本研究结果表明，外源性施加CCL6导致心肌细胞中IGF2-AS表达降低，从而激活Akt/GSK-3β信号通路发挥心肌保护的作用。