本研究拟以H9c2心肌细胞缺氧/复氧（H/R）模型和小鼠心肌缺血/再灌注（I/R）模型模拟MI/RI，在离体细胞和在体组织中探讨p‑FoxO4在MI/RI中的作用，为临床治疗MI/RI寻求新靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　H9c2心肌细胞的培养

将H9c2心肌细胞用含有10%胎牛血清及1%青霉素‑链霉素的DMEM高糖培养基于含有5%CO2的37 ℃恒温培养箱培养，隔天观察细胞状态，更换培养液并定期传代。

1.2　H9c2心肌细胞H/R模型的制备

用含95%N2、5%CO2无氧气体，流速1 L/min，充分饱和无糖培养基30 min备用。弃H9c2心肌细胞正常高糖培养基，PBS洗3遍并迅速加入适量的经无氧气体充分饱和的无糖无血清培养基。将细胞板放入缺氧小室，并用上述无氧气体置换缺氧小室内的氧气，30 min后用含有5%CO2的缺氧气体，37 ℃恒温培养箱中培养1 h。缺氧完成后将细胞培养基更换为正常培养基，于恒温培养箱中分别培养1、3、6 h。

1.3　小鼠心肌I/R模型建立

选择6~8周雄性SPF级C57/BL6小鼠，腹腔注射1%戊巴比妥50 mg/kg麻醉后进行气管插管，用小鼠呼吸机进行机械通气，潮气量为0.15 ml，呼吸频率100次/min。在小鼠胸骨左缘第四肋间开胸，结扎心脏左冠状动脉前降支30 min后，松开结扎线进行再灌注3、6、12、24 h。

1.4　实验分组

待H9c2心肌细胞培养24 h后，按随机数字表法分成4组：对照组（Control组）、缺氧1 h复氧1 h组（H1R1组）、缺氧1 h复氧3 h组（H1R3组）和缺氧1 h复氧6 h组（H1R6组）。Control组细胞不做任何处理，H1R1组细胞缺氧1 h复氧1 h，H1R3组细胞缺氧1 h复氧3 h，H1R6组细胞缺氧1 h复氧6 h。完成H/R处理后进行项目检测。

采用随机数字表法将小鼠分为5组（每组3只）：假手术组（sham组）、缺血30 min再灌注3 h组（R3组）、缺血30 min再灌注6 h组（R6组）、缺血30 min再灌注12 h组（R12组）、缺血30 min再灌注24 h组（R24组）。Sham组在心脏结扎处穿线，但不结扎。R3组结扎冠状动脉左前降支30 min后再松开结扎线进行灌注3 h，R6组缺血30 min后再灌注6 h，R12组为缺血30 min后再灌注12 h，R24组为缺血30 min后再灌注24 h。

1.5　细胞增殖‑毒性检测试剂盒检测H9c2心肌细胞相对存活率

将含1×105个H9c2细胞的100 μl细胞悬液均匀种植于96孔板中，每组6个复孔，并设置空白对照组，进行H/R处理后，每孔加入10 μl CCK‑8溶液于培养箱中孵育1 h，用酶标仪450 nm测定各孔光密度（D）值，计算细胞活力。细胞相对存活率=（实验组D值－空白组D值）/（对照组D值－空白组D值）×100%。

1.6　实时定量聚合酶链反应qPCR）检测FoxO4、Bim、Bcl‑2和Bax的mRNA表达

将H9c2细胞均匀接种于6孔板中，分成Control组、H1R1组、H1R3组和H1R6组，每组3个复孔；在动物实验中则对5组小鼠心肌进行取材，均采用Trizol试剂（生产批号：15596‑026，北京索莱宝科技有限公司）提取细胞中的总RNA，检测RNA浓度及纯度，将RNA逆转录成cDNA，FoxO4、Bim、Bcl‑2、Bax及内参引物序列由上海生工生物工程设计与合成，FoxO4上游引物为GAATCCTGGGGGCTGTAA，下游引物为GCTGATGAGTTCTGCATATGAC；Bim上游引物为GCACTGACTGACTGGCTCTGTTC，下游引物为GAGAGGCAGCAGAATCCAAGCAC；Bcl‑2上游引物为GATGACTTCTCTCGTCGCTAC，下游引物为GAACTCAAAGAAGGCCACAATC；Bax上游引物为TTGCCCTCTTCTACTTTGCTAG，下游引物为CCATGATGGTTCTGATCAGCTC；内参上游引物为GGGAGGTGATAAGCGATGAA下游引物为AGGGACATA‑ CTTGCCACCTG。逆转录过程分两步：第一步为去基因组DNA反应，将1 μg RNA、1 μl DNA和DEPC水共10 μl混合，45 ℃孵育5 min，反应结束后于冰上静置；第二步为逆转录反应，将第一步冰上静置过的10 μl混合液加入10 μl的2*NovoScript® Plus 1st Strand cDNA Synthesis Supermix轻轻混匀。50 ℃ 孵育30 min，再75 ℃孵育5 min，终止反应，获得的cDNA样品−20 ℃保存。qPCR体系包括前后引物各1 μl、subgreen 5 μl、DEPC水2 μl、cDNA 1 μl，共10 μl。扩增条件为95 ℃ 1 min，每个循环为95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，45个循环。以β‑tubulin为内参，每组目的基因和内参重复3孔。荧光定量PCR仪器检测的CT值是每个样本的荧光强度达到预先设定阈值的循环数，目的基因的mRNA相对表达量=2−∆∆CT×100%。

1.7　Hoechst试剂盒检测细胞凋亡率

将H9c2心肌细胞均匀接种于载玻片上，分为Control组和H1R1组，每组重复3次，加入培养基过夜，使密度为50%~80%，行H/R处理后使用Hoechst 试剂盒进行固定，染色，封片。荧光显微镜观察被染色细胞核的形态，并计算细胞凋亡率（细胞凋亡率=同一视野中凋亡细胞数/所有细胞数×100%）。

1.8　Western blot 法检测H9c2心肌细胞蛋白表达

将H9c2心肌细胞接种于中号培养皿，每组重复3次，进行相应H/R处理后提取蛋白，并用BCA试剂盒检测蛋白浓度，每组各取30 μg进行SDS‑PAGE电泳分离蛋白。将蛋白转移到偏二氟乙烯膜，并用5%脱脂牛奶（生产批号：S30865，上海源叶生物科技有限公司）封闭2 h，再用对应分子的抗体（抗FoxO4抗体、抗磷酸化FoxO4抗体、抗Bim抗体、抗Bcl‑2抗体、抗Bax抗体）封闭4 ℃过夜，再用Tris缓冲盐水吐温溶液（TBST）洗膜3次，每次15 min，用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体孵育2 h，再次用TBST溶液洗膜3次，每次15 min，进行显色。结果用Image J软件分析条带的灰度值，并以目的条带/β‑tubulin的灰度值计为目的蛋白表达量。

2 结 果

2.1　细胞相对存活率比较

与Control组［（99.4±3.8）%］比较，H1R1组［（50.6±4.1）%］、H1R3组［（65.2±4.0）%］和H1R6组［（78.4±1.9）%］细胞相对生存率下降，H1R1组最低（P