发明内容 本发明人从枯草芽孢杆菌NCD-2菌株中克隆出phoP和phoR基因，在进行序列比对时意外发现，在芽孢杆菌属内不同种的菌株之间phoP/phoR双因子调控系统基因序列 (指phoP和phoR两个基因的全序列)存在较高的变异性，因此，本发明人提出将phoP/phoR 双因子调控系统内部的部分核苷酸序列用于芽孢杆菌的鉴定分类，本发明中用“phoPR”或 “phora基因”来表示所述的phoP/phoR双因子调控系统的部分核苷酸序列。本发明目的在于提供一种用于鉴定芽孢杆菌的基因扩增通用引物。本发明另一目的是提供利用上述基因扩增通用引物对芽孢杆菌进行分类鉴定的方法。本发明第三目的是提供含有上述基因扩增通用引物的芽孢杆菌分类鉴定试剂盒。为实现上述目的，本发明的技术方案如下本发明用于鉴定芽孢杆菌的基因扩增通用引物，所述的基因扩增通用引物由上游简并引物PhoPR-F和下游简并引物PhoPR-R组成，所述简并引物的核苷酸序列为phoPR-F 5' GG (G/C/T/A) TA (T/C) AAA (A/T/C/G) A (G/A) GAGGAGCC 3，(SEQID No: 1)，PhoI3R-R :5，TT (C/T) A (G/A) (C/T) TCATG (A/G) GA (A/C/G) ACATT 3，(SEQ IDNo 2)。上述用于鉴定芽孢杆菌的基因扩增通用引物中所述的基因扩增可以是PCR扩增。利用上述基因扩增通用引物对芽孢杆菌进行分类鉴定的方法，按照如下步骤进行(1)以待测菌株的基因组DNA为模板，以上游简并引物phoPR-F和下游简并引物 PhoPR-R为引物进行PCR扩增，对扩增所得的DNA片段进行回收、纯化、测序；其中所述的简并引物为phoPR-F :5，GG (G/C/T/A) TA (T/C) AAA (A/T/C/G) A (G/A) GAGGAGCC 3，(SEQID No: 1)；PhoI3R-R :5，TT (C/T) A (G/A) (C/T) TCATG (A/G) GA (A/C/G) ACATT 3，(SEQ IDNo 2)；(2)将步骤(1)测序所得待测菌株的phora基因的核苷酸序列与GeneBank数据库(美国国立生物技术信息中心(Nat ional Center for Biotechnologylnformation，简称 NCBI)，网址;http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/Ruide)中所有芽孢杆菌的 phoP/phoR 基因的核苷酸序列进行序列比对，序列比对结果中与待测菌株序列相似性最高的菌株所属的种，即为该菌株所属的种。上述分类鉴定的方法步骤(2)中所述的序列比对结果，如果该菌株和某一菌株的序列相似性为100%，那么可能是相同菌株；如果序列相似性不是100%，就属于新菌株。上述分类鉴定的方法步骤(1)中所述的PCR扩增，按照本领域技术人员熟知的方法进行，其反应体系为10 XBuffer (+Mg2+) 5 μ l，dNTPs 8 μ 1, phoPR-F 1 μ l，phoPR-R 1 μ 1, 待测菌株基因组 DNA (约 IOng) 1 μ 1，rTaq DNA 聚合酶 1 μ 1，ddH20 33 μ 1 ；共 50 μ 1。上述分类鉴定方法步骤(1)中所述的PCR扩增，按照本领域技术人员熟知的方法进行，其 PCR 反应条件为95°C 5min ；94°C 45s，48°C 45s，72°C lmin，共 35 个循环；72°C IOmin0 上述分类鉴定的方法步骤(2)中所述的序列比对是将扩增所得的待测菌株的PhoI3R基因序列与GenBank数据库中所有的芽孢杆菌的phoP/phoR基因序列通过 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)进行序列比对；对比结果中与待测菌株序列相似性最高的菌株所属的种，即为该菌株所属的芽孢杆菌的种。上述分类鉴定的方法步骤(1)中所述的PCR扩增的DNA片段的回收和测序，按照本领域技术人员熟知的方式，将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，然后纯化、回收扩增所得的目的片段；将回收的目的片段连接到PEASY-T质粒载体上，再热击转化大肠杆菌DH5ci的感受态细胞，选择白色菌落，并以M13/RV-P为引物，通过PCR方法对白色菌落进行验证，如果通过PCR方法能获得大约1. 5kb的扩增片段，则该白色菌落为正确的菌落；挑选经过验证的菌落送交专业测序公司进行测序。所述的引物为M13 :5， cgacgttgtaaaacgacggccagt 3， (SEQ ID No 3)RV-P 5' ggaaacagctatgaccatgattac 3' (SEQ ID No 4)在应用上述分类鉴定方法之前，也可以首先对待测菌株进行形态鉴定、生理生化鉴定或者16s rDNA序列分析等，确定其是否为芽孢杆菌；在确定为芽孢杆菌后，再利用 phora基因序列进行分类。上述分类鉴定的方法步骤(2)中，还可利用Clustal X软件对2个以上的未知菌株的phora基因序列进行多重序列比对，比对过程中同时加入不同种的标准菌株的PhoPR 基因序列；然后利用MEGA软件构建系统发育树，在系统发育树中与待测菌株亲缘关系最近的标准菌株所对应的种，即为该菌株所属的种。所述的不同种的标准菌株的ph#R基因序列可通过上述PCR方法扩增、测序获得； 亦可通过直接在Genbank数据库中选择相应的标准菌株的序列。所述的Clustal X软件是用于多序列比对的软件。Clustal X软件可从互连网上下载。Ijf^MEGA (Mo 1 ecu 1 ar Evolutionary Genetics Analysis, j^^J&itMi^^fr) 是研究分子进化遗传分析的软件，用于序列比对、进化树的推断、估计分子进化速度、验证进化假说等。MEGA软件可从互联网上下载。上述分类鉴定方法步骤(1)中所述的待测菌株基因组DNA的提取，可以按照本领域技术人员熟知的方法进行，如碱裂解及苯酚-氯仿抽提法((SlBeyer 等.Microbiological research. 1995,150 179)。一种芽孢杆菌分类鉴定试剂盒，含有由SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示的核苷酸序列组成的基因扩增通用引物。该引物可用于进行PCR扩增。按照本领域技术人员熟知的方式，上述芽孢杆菌分类鉴定试剂盒还包括dNTPs、 10XBuffer、rTaq DNA聚合酶和超纯水。所述的基因扩增通用引物phoPR-F和phoPR-R由人工合成。同现有的芽孢杆菌的鉴定方法相比，本发明具有以下优点(1)利用本发明通用引物进行扩增所得的DNA片段多态性非常丰富，通过它们对芽孢杆菌进行分类鉴定，能将所有的芽孢杆菌菌株进行分类，其所得分类结果准确，可靠性高；(2)本发明通用引物不仅能将芽孢杆菌菌株在种的水平 上进行分类，而且还可进行亚种水平的分类，即对同一种内不同的菌株进行准确鉴定，而用现有方法对有些种内不同的菌株难以区分；(3)本发明分类鉴定方法简单、鉴定速度快，本发明方法鉴定一个新菌株只需要1-3天即可；而现有方法鉴定一个新菌株至少需要2周时间。

图1为不同种的芽孢杆菌标准菌株phora基因的PCR扩增产物的电泳图谱；其中M.DL2000 DNA marker, 1.枯草芽孢杆菌(B. subtilis) 168，2.萎缩芽孢杆菌 (B. atrophaeus)SB512,3.解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)FZB42，4.地衣芽孢杆菌(B. licheniformis) ATCC8480，5.短小芽孢杆菌(B. pumilus) ATCC7061，6.坚强芽孢杆菌(B. firmus)NRS854，7.巨大芽孢杆菌(B. megaterium)899，8.苏云金芽孢杆菌 (B. thuringiensis)HD2,9.赌样芽孢杆菌(B. cereus)E33L。图2为不同的芽孢杆菌16S rDNA的PCR扩增产物的电泳图谱。其中1. NCD-2, 2. BAB-1,3.TQk-TΛ. XJT-7,5.HMB6246，6. HMB6241，7. HMB 6311,8. HMB6315，9. HMB6262, 10. HMB6243,11. HMB6236,12. HMB6283,13. HMB6256,14. SP-8-2，15. NZT-55，16.枯草芽孢杆菌168，17.解淀粉芽孢杆菌FZB42。图3为利用phoPR基因对不同种的芽孢杆菌的标准菌株构建的系统发育树。图4为利用16S rDNA序列对分类地位未知的芽孢杆菌构建的系统发育树。图5为利用phoPR基因对分类地位未知的芽孢杆菌构建的系统发育树。 具体实施例方式以下以具体实施例对本发明做进一步的说明，但是不对本发明构成任何限制。如无特别说明，以下实施例中所涉及的方法皆为本领域技术人员熟知的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》等。以下实施例中所用的rTaqDNA聚合酶、dNTPs、T4DNA连接酶购自大连宝生物 (TaKaRa)公司，pEASY_T载体及大肠杆菌DH5 α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，其它分子生物学试剂购自上海生工生物有限公司。实施例1 不同种的芽孢杆菌之间phoPR和gyrB基因多态性比较试验本试验中所涉及的9个代表性的芽孢杆菌标准菌株分别为菌株枯草芽孢杆菌(B. subtilis) 168,解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)FZB42,地衣芽胞杆菌(B. licheniformis) 14580，短小芽孢杆菌(B. pumilus) SAFR-032,韦氏芽孢杆菌(B. weihenstephanensis) KBAB4,赌样芽胞杆菌(B. cereus) 03BB102,克劳氏芽孢杆菌(B. clausii)KSM-K16，巨大芽孢杆菌(B. megaterium)DSM319和苏云金芽孢杆菌 (B.thuringiensis)BMB1710本试验中对芽孢杆菌属不同种的9个标准菌株分别用phoPR-F/phoPR-R引物和 gyrB-F/gyrB-R引物进行PCR扩增，然后进行测序和序列对比。按照如下方法进行(1)菌株活化将芽孢杆菌菌株于LB培养基(LB培养基组成成分及其比例为每 IOOOml中胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g、琼脂粉10g、其余为水)上活化。 (2)芽孢杆菌基因组DNA的提取将芽孢杆菌单一菌落接种到5ml LB液体培养基中(其组成成分及其重量百分比为胰蛋白胨10%、酵母提取物5%，NaCl 5%，其余为水)，在30°C、150rpm条件下震荡培养14h，取菌液Iml，12000rpm离心2min，收集菌体(沉淀)，菌体用TE缓冲液冲洗，并再次用TE缓冲液500 μ 1悬浮，然后加入溶菌酶50 μ 1 (50ng/ μ 1)，37°C温浴40min，然后利用SDS-碱裂解法提取芽孢杆菌的基因组DNA(参见Beyer 等.Microbiologicalresearch. 1995,150 179)。(3) phoPR基因的PCR扩增以芽孢杆菌的基因组DNA为模板，以phoPR-F (SEQ ID No 1)和phoPR-R (SEQ ID No 2)为引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳、回收、纯化，再送上海生工进行测序。其中PCR反应体系为 10 XBuffer (+Mg2+) 5 μ 1，dNTPs 8 μ 1，引物 phoPR-F 1 μ 1，引物 phoPR-R 1 μ 1，步骤(2)所得的基因组 DNA (约 10ng)ly 1，rTaq DNA 聚合酶 1 μ 1，ddH20 33 μ1，*50μ1。PCR 反应条件为95°C预变性5min ；94°C变性45s，48°C退火45s，72°C延伸lmin，共35个循环；最后 72°C链延伸 IOmin。 (4) gyrB基因的pCR扩增以芽孢杆菌的基因组DNA为模板，以gyrB_F和gyrB-R 为引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳、回收、纯化，再送上海生工进行测序。其中 PCR 反应体系为10XBuffer (+Mg2+) 5 μ 1，dNTPs 8 μ l,gyrB-F 1μ 1, 引 gyrB-R 1 μ 1，步骤(2)所得的基因组 DNA (约 IOng) 1 μ 1，rTaq DNA 聚合酶 1 μ 1，ddH20 33μ 1，共 50μ 1。PCR 反应条件为95°C 预变性 5min ；94 °C 变性 45s，55 °C 退火 45s，72 °C 延伸lmin，共35个循环；最后72°C链延伸lOmin。所述的gyrB_F和gyrB-R引物的核苷酸序列为gyrB-F 5' TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT 3，(SEQID No 5)； gyrB-R 5' TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC 3，(SEQ ID No 6)；(5)电泳检测取5 μ IPCR扩增产物，加入1 μ 1 6 X Loading Buffer,混勻后加入含有琼脂糖凝胶的点样孔中，IOOV电压电泳40min。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于Gold View染料(购自北京赛百盛有限公司)中染色30min，然后置于紫外检测器下观察(见图 1)。简并引物表1不同种的芽孢杆菌之间phoP/phoR双因子基因序列的序列相似性(％ ) ^ p^—^^ffij^ft c%)~ΓΙ Yi [3 p [1 Γ Yi [8 |~9 号菌株名称^------------------ Τ~ 解淀粉芽孢杆菌 FZS幻 10073.4 64.1 60.9 57.353.4 56.9 57.0 57.1 Τ~ 枯草芽孢杆菌 168"l00 65.2 62.5 60.554.0 58.9 “ 58.5 59.6— 地衣芽胞杆菌“ 100 62.9 59.655.7 57.8 57.4 57.7 T"短小芽孢杆菌 SAFR-032100 58.454.4 60.6 ~606~ 60.5 巨大芽孢杆菌 DSM3]9100"5 y 65.1 64J~ 65.6 ‘ " 克劳氏芽孢杆菌 KSM-Kl6—1θΓ~ 54.4 54.3 Τ"苏云金芽孢杆菌ΒΜΒ17「— “100 92.厂92.2 Τ~蜡样芽孢杆菌E33L"100 91.6 ~9丨韦氏芽抱杆菌尤似^/丨丨丨100表2不同种的芽孢杆菌之间gyrB基因的序列相似性(％ ) 权利要求 1.用于鉴定芽孢杆菌的基因扩增通用引物，其特征在于所述的通用引物由上游简并引物和下游简并引物组成，所述的上游简并引物由SEQ ID No :1所示的核苷酸序列组成，所述的下游简并引物由SEQ ID No :2所示的核苷酸序列组成。 2.利用权利要求1所述的通用引物对芽孢杆菌进行分类鉴定的方法，按照如下步骤进行(1)以待测菌株的基因组DNA为模板，以上游简并引物和下游简并引物为引物进行PCR 扩增，对扩增所得的DNA片段进行回收、纯化、测序，得phora基因序列；其中所述的上游简并引物由SEQ ID No 1所示的核苷酸序列组成，所述的下游简并引物由SEQ ID No 2所示的核苷酸序列组成；(2)将步骤(1)测序所得待测菌株的ph#R基因的核苷酸序列与GeneBank数据库中所有芽孢杆菌的phoP/phoR基因的核苷酸序列进行序列比对，序列比对结果中与待测菌株序列相似性最高的菌株所属的种，即为该菌株所属的种。 3.按照权利要求2所述的分类鉴定的方法，其特征在于其步骤(2)中所述的序列比对是将扩增所得的待测菌株的Phora基因序列与GenBank数据库中所有的芽孢杆菌的phoP/ PhoR基因序列通过BLAST进行序列比对；对比结果中与待测菌株序列相似性最高的芽孢杆菌菌株所属的种，即为该菌株所属的芽孢杆菌的种。 4.利用权利要求1所述的通用引物对芽孢杆菌进行分类鉴定的方法，按照如下步骤进行(1)以待测菌株的基因组DNA为模板，以上游简并引物和下游简并引物为引物进行PCR 扩增，对扩增所得的DNA片段进行回收、纯化、测序，得phora基因序列；其中所述的上游简并引物由SEQ ID No :1所示的核苷酸序列组成，所述的下游简并引物由SEQ ID No :2所示的核苷酸序列组成；(2)利用ClustalX软件对2个以上的未知菌株的phora基因序列进行多重序列比对， 比对过程中同时加入不同种的标准菌株的Phora基因序列；然后利用MEGA软件构建系统发育树，在系统发育树中与待测菌株亲缘关系最近的标准菌株所对应的种，即为该菌株所属的种。 5.按照权利要求2、3或4所述的分类鉴定的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的PCR 扩增的反应体系为10XBuffer 5 μ l，dNTPs 8 μ l,phoPR-Fly l，phoPR-R 1μ 1，待测菌株基因组 DNA 1 μ 1，rTaq DNA 聚合酶 1 μ 1，ddH2033 μ 1 ；共 50 μ 1。 6.按照权利要求5所述的分类鉴定的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的PCR扩增的反应条件为95°C 5min ；94°C 45s, 48°C 45s, 72°C lmin，共 35 个循环；72°C IOmin0 7.一种芽孢杆菌分类鉴定试剂盒，其特征在于含有由SEQ ID No :1和SEQID No :2所示的核苷酸序列组成的基因扩增通用引物。 8.按照权利要求7所述的芽孢杆菌分类鉴定试剂盒，其特征在于还包括dNTPs、 10XBuffer、rTaq DNA聚合酶和超纯水。 全文摘要 本发明公开了一种用于鉴定芽孢杆菌的通用引物，所述的通用引物由SEQID No1所示的核苷酸序列组成的上游简并引物和由SEQ ID No2所示的核苷酸序列组成的下游简并引物组成。本发明还公开了对芽孢杆菌进行分类鉴定的方法，即利用通用引物进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行测序，再利用序列比对软件在Genbank数据库中进行序列比对，序列相似性最高的已知菌株所属的种即为该菌株所属的种。利用本发明通用引物能将所有的芽孢杆菌进行分类，其分类结果准确，可靠；其次，本发明通用引物不仅能将芽孢杆菌在种的水平上进行分类，而且还可进行亚种水平的分类；此外，本发明分类鉴定方法简单、鉴定速度快。 文档编号C12Q1/68GK102226216SQ20111014232 公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日 发明者李宝庆, 李社增, 郭庆港, 马平, 鹿秀云 申请人:河北省农林科学院植物保护研究所