一、实验技术流程

按照实验材料的不同，实验方法可以分为三类：

1.烟草叶片：构建载体→农杆菌转化-注射烟草叶片→激光共聚焦显微镜观察

2.洋葱表皮：载体构建→农杆菌转化法/基因枪法→激光共聚焦显微镜观察

3、原生质体：构建载体→制作原生质体+转化质粒→激光共聚焦显微镜观察

以烟草叶片作为实验材料时：

1、烟草培养：播种烟草种子若干，12h弱光照培养，培养一个月即可用于实验。

2、农杆菌培养：将构建好的载体质粒通过电转化法转入农杆菌（GV3101、EHA105或LB4404等），30℃培养2d。

3、悬浮农杆菌：用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下，接于10mL YEB液体培养基中，170×g培养1h。

4、收集菌体：4000×g，离心4min，去上清。

5、重悬：用10mM MgCl2（含120μM AS）悬浮液重悬菌体，调OD600至0.6左右。

6、注射：挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1mL注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注。

7、培养：将注射完成的烟草植株弱光培养2d，即可观察。

8、观察：取标记的农杆菌注射的烟草叶片，制作成玻片，激光共聚焦显微镜下观察，并拍照。

注：共定位时，将Marker质粒转化农杆菌，和构建完成的载体质粒农杆菌一起悬浮操作，在注射前按1：1比例混合，然后注射烟草叶片。

以洋葱表皮作为实验材料时（农杆菌介导法）：

1、农杆菌培养：将构建的载体质粒与Marker质粒利用电转化法分别转入农杆菌（GV3101、EHA105、LB4404等），30℃培养2d；

2、悬浮农杆菌：用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下，接种于10mL YEB液体培养基中，170rpm/min培养1h；

3、收集菌体：4000rpm/min，离心4min，去上清；

4、重悬：用10mM MgCl2（含120μM AS）悬浮液重悬菌体，将OD600调至0.6左右。共定位时，将Marker质粒转化农杆菌，和构好的载体质粒农杆菌一起悬浮操作，在注射前按1:1比例混合；

5、侵染：将洋葱球茎内4-7层表皮用75%乙醇消毒后，撕取1cm2左右内表皮置于混合菌液中，20min后取出，将内表皮置于MS培养基中，25℃暗培养12h，光培养24h。

6、观察：将洋葱内表皮平铺在载玻片上，放上盖玻片轻轻按压几下，置于激光共聚焦显微镜下观察，并拍照。

以洋葱表皮作为实验材料时（基因枪法）：

1、材料准备：将洋葱内层鳞片切成1-2cm2小块，用镊子撕取内表皮细胞层，光滑面向上，平铺于MS平板上中心区域，预培养4h，备用；

2、金粉准备：称取60mg金粉放入1.5mL EP管中，加入1mL无水乙醇，涡旋振荡1-2min，冰上静置5min后，10000rpm离心1min，去上清，重复上述步骤重新清洗金粉三次，室温10000rpm离心1min，去上清；加入1mL无菌去离子水，涡旋振荡1-2min，冰上静置5min；室温10000rpm离心1min，去上清，加入1mL无菌去离子水，按50μL每份分装到己灭菌的1.5mL EP管中备用；

3、DNA包裹金粉微粒；

4、基因枪轰击：载体膜、可裂膜、阻拦网等事先置于70%乙醇中1min，灭菌滤纸上自然风干；将气瓶调节压力到1300psi；取8-9μL已用DNA包裹好的微粒悬浮液加到微粒载体膜中央，稍微晾干后马上进行轰击；将可裂膜、阻拦网、涂有微粒载体膜安装进固体装置中，射击参数为：轰击微粒运行距离为12cm，压力1110psi，真空度25mmHg；轰击结束后的材料，转移到MS培养基中培养24h；使用激光共聚焦显微镜488nm波长激发下，观察荧光信号。

以原生质体作为实验材料时：

1、将水稻的种子水培发芽，30°C左右暗培养7-15d。

2、取出15棵7-15d幼苗，于干净塑料/玻璃板上将茎秆切成小于0.5mm的小段，并及时转入0.6M甘露醇中。

3、待所有幼苗切完后，于0.6M甘露醇中平衡10min。酶解液降至室温，加入后续试剂。吸去甘露醇溶液，加入室温酶解液，以全部浸泡组织为宜。置于真空箱中30min，置于室温，50×g，酶解3.5h。

4、酶解完成后，加入10mL W5后，在水平摇床上以80×g速度释放原生质体，释放10min。

5、100×g，室温下离心过滤液7min，加速减速设置为slow。慢慢吸取上清液，勿将所有上清液吸去。

6、加入约3mL W5悬浮原生质体，轻轻晃动离心管以摇散原生质体。吸取10μL原生质体悬浮液镜检，调整原生质体浓度到2.0×105/mL（镜检：原生质体圆润，破裂较少），置原生质体悬浮液于暗处，室温保存60min。准备转化用的质粒。

7、100×g，室温下离心7min，弃去上清。将原生质体悬浮于MMG溶液中（单转加100μL原生质体，共转加200μL原生质体），并将浓度调整到2.0×105/mL。

8、取100μL原生质体悬液+10μL DNA，若是共转则取200μL原生质体悬液+20μL DNA（10μL目的基因载体质粒+10μL marker质粒），取与DNA和原生质体体积之和相等的 PEG4000溶液（110μL），轻弹混匀。28°C，黑暗中转化10-15min。

9、加入1mL W5溶液，上下颠倒终止反应。

10、600×g离心5min收集原生质体，除去上清。

11、加入1mL W5溶液洗涤1-2次。

12、最后加入1mL W5溶液，28°C暗培养18-24h后，600×g离心5min，吸去上清，只留100μL原生质体，荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜观察。

二、实验重难点

1、烟草瞬时转化常见的问题：

1）转化效率低：注意农杆菌的活性，建议侵染烟草叶片的农杆菌OD600值为0.6；

2）生长4-5周的烟草苗比较适合注射；

3）尽量选择生态位靠上的幼嫩叶片；

4）对异常定位情况可加P19或泛素化抑制剂等降低异源表达影响。

2、原生质体瞬时转化的注意事项：

1）原生质体非常脆弱敏感，操作需轻缓，环境培养温度要求严苛；

2）W5溶液是维持细胞渗透压最关键的溶液：浓度过高，细胞会发生皱缩，浓度过低，会导致细胞破裂；

3）W5溶液的最适为pH =5.7-5.8；

4）苗龄过高（一般不超过二叶期）或育苗时水分不足会产生较多的淀粉粒，影响后续转染；

5）细胞经过多次洗涤，在洗涤转移上清液时，枪头要从上部轻轻吸取，尽量减少细胞震荡，避免细胞损失；

6）目前多用PEG介导转化，对PEG及各个试剂质量纯度要求较高。

三、与其他同类型实验相比优势与劣势

优势：

1.速度快、灵敏度高，可以同时检测多种分子的位置。

2.操作较为简单易行。

3.成本相对较低，不需要借助抗体。

劣势：

1、分辨率较低，只能观察到分子的大致位置。

四、我司该实验业务优势

1、采用伯远生物已被授权的国际PCT专利技术（专利号：US 10,144,936 B2）来进行亚细胞定位载体的构建，且该组装为无缝组装，可排除非必要的序列干扰实验结果；

2、伯远生物建立了丰富的亚细胞定位载体资源，包含了基于红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白的载体库，方便选择使用；

3、拥有细胞核、细胞膜、液泡膜、内质网、过氧化物酶体、高尔基体、线粒体等多种细胞器的Marker载体（mCherry荧光），以方便共定位时选择；

4、常备水稻、烟草、小麦、玉米、拟南芥等的原生质体以及烟草叶片，每周定期观察，可快速获得观察结果；

5、每个基因拍5-6个细胞，保证实验的可靠性与可重复性。

五、常见问题答疑

1、为什么有时候会出现亚细胞定位结果与预测结果不符的情况？

各种基因预测定位的都是基于现有的生物学数据和已有的生物学知识，在不同的模型或算法基础上建立的不同分析程序有一定的适用范围和相应的限制条件，生物信息学的预测结果只能作为参考，为后续试验提供研究思路，但具体的表达定位情况还是以实际实验结果为准。注意有些蛋白会在多种细胞器中穿梭行使功能，也有些蛋白受不同环境影响而改变其亚细胞定位的位置，因此在不同时间或环境下观察到目的蛋白定位于不同结构上也是正常现象。

2、什么样的基因适合在原生质体里做定位，什么样的基因适合在烟草植株中做定位？

一般大家会根据自己研究的物种来选择使用什么受体，原生质体是没有细胞壁的不完整的植物细胞，所以对外界逆境反应很敏感，所以有些蛋白表达后对原生质体有一定的毒性作用，导致无法观察到荧光；在烟草体系中，因为是注射法浸染烟草细胞，而完整的植物细胞对逆境的抗性更强，所以表达后容易观察到荧光。如果有些基因需要较长的时间表达，则更适合在烟草中操作；烟草细胞中细胞壁、细胞质和细胞膜等都会挤在一起，不便于区分；所以定位到具体细胞器的基因更适合在原生质体中表达，观察更明显。

3、多次尝试不同的载体，以及GFP的连接方向，对目的序列进行截短（目的测序没问题），但是始终看不到亚细胞定位结果，没有荧光，会有哪些原因？

1）从头梳理一下实验过程，看看实验过程是否存在问题，有没有设置阳性对照，阳性对照是否正常表达？

2）基因表达量怎么样？如果表达量低的话，荧光不明显，也可能观察不到；另外，存不存在特异性表达（特殊部位/特殊时期/特殊条件）？

3）有没有更换不同受体材料进行尝试。

4）基因过表达—翻译—折叠形成蛋白，这个过程任何一步存在问题都有可能导致无荧光。

5）蛋白大小怎么样？如果过大，有没有在GFP和目的基因之间插一段linker，以免目的蛋白将GFP包裹起来，导致没有荧光。

4、原生质体形态成椭圆型，粘连在一起可能是什么原因？

如果酶解出来的原生质体是椭圆型，可能是酶解液配制的不合适需要调整一下渗透压，另外就是苗子选用的时期，一般来说尝试制备原生质体的时候建议用组培苗效果会比较好，原生质体粘连这个可能是受物种本身的影响，例如有一些水稻品种酶解出来的原生质体会存在粘连的情况，可以在重悬时可多加一些缓冲液。

5、共定位时，两个基因大小相差较大，表达时间可能有差异，如何使基因表达同步？

首先确定两个基因构建的载体骨架及所用启动子是否是一样的，因为蛋白表达时间差异受启动子影响，如果不是的话，建议更换载体，用同一种启动子。另外可以延长培养时间，设置不同时间段观察，看是否能观察到。

6、烟草共定位实验时，共聚焦显微镜扫描时有叶绿体干扰，如何去除叶绿体干扰？

有叶绿体干扰背景可能是光打的太强了，可以把通道的光打弱。如果说打弱之后观察不到GFP荧光，那就可能是本身荧光亮度就很弱，这种情况下强行把光打强，叶绿体肯定是会产生干扰的。