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作者：

李丹丹

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摘要：

本研究克隆了核盘菌2个基因Sscut2(Cutinase)和Ssmfs1(Major Facilitator Superfamily),对Ss CUT2进行了原核表达,同时采用同源重组的基因敲除策略,利用PEG介导的原生质体的转化对Sscut2和Ssmfs1分别进行了基因敲除(分割标记法).采用菌丝尖端纯化和子囊孢子单孢分离获得纯合的敲除突变体.SsCUT2基因原核表达后重组蛋白可引起本氏烟产生类似过敏性反应(HR)的细胞死亡.DAB染色后,发现叶片坏死区域产生大量的铁锈色,推测Sscut2诱发植物活性氧的迸发,具有类似激发子的功能.Sscut2敲除突变株与野生型菌株相比在PDA培养基上菌丝生长速率,菌落形态,菌核的形成以及产酸能力方面差异不显著.进一步测定了Sscut2敲除突变体ΔSscut2-5,ΔSscut2-7和ΔSscut2-17对Na Cl,多菌灵,刚果红等5种胁迫因子的耐受情况:与野生型菌株相比,在0.01%SDS,6 m M H_2O_2及1.2 M山梨醇的胁迫环境下,Sscut2敲除突变体敏感性较高,菌株的菌落直径明显受到抑制;在0.5 M Na Cl和刚果红的胁迫环境下,与野生型相比敏感性较低,但菌落形态没有明显差异;在0.3μg/m L多菌灵的处理下,Sscut2不参与杀真菌剂的耐受性.Sscut2敲除突变的菌丝尖端分枝变多变短,侵染数量减少,野生型菌株分支较少且长;ΔSscut2敲除突变体在油菜,大豆,本氏烟,拟南芥和番茄叶片上的致病力显著下降.表明Sscut2在核盘菌的致病过程中发挥着重要作用.Ssmfs1敲除突变株与野生型菌株相比在PDA培养基上菌丝生长速率,菌落形态,菌核的形成以及产酸能力方面差异不显著.进一步测定了Ssmfs1敲除突变体ΔSsmfs1-1和ΔSsmfs1-2对Na Cl,多菌灵,刚果红等5种胁迫因子的耐受情况:与野生型菌株相比,在0.01%SDS的胁迫环境敏感性较高,其他4种胁迫因子的敏感性较低.在0.3μg/m L多菌灵的处理下,核盘菌Ssmfs1不参与杀真菌剂的耐受性,Ssmfs1基因缺失后的产酸能力并没有消失.Sscut2敲除突变的菌丝尖端分枝变多变短,侵染数量减少,野生型菌株分支较少且长;ΔSsmfs1在油菜,本氏烟,拟南芥和番茄叶片上的致病力显著下降.表明Ssmfs1与核盘菌的致病过程中发挥着重要作用.综上所述,Sscut2基因不影响核盘菌生长发育,但参与核盘菌的致病过程.Ssmfs1基因在核盘菌生长发育上均未产生影响,但与核盘菌的致病机理相关,是一个核盘菌致病相关的基因.

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