NF

#NF| 来源: 网络整理| 查看: 265

NF-kB是近年发现的转录因子家族中的新成员，是细胞内最重要的核转录因子，他在许多细胞刺激介导的细胞信息的转录调控中起核心作用，参与多种基因的表达和调控，是细胞激活的标志.NF-κB一般以同源或异源二聚体形式存在.在静息细胞中，NF-kB二聚体通过非共价键的形式与其抑制蛋白IkB结合而分散在细胞质内，包括内质网应激在内的许多因素可激活NF-kB，激活后的NF-kB进入细胞核，与DNA模块上的特异蛋白结合，诱导特异mRNA的产生，最后转录、产生和释放各种细胞因子.NF-κB，激活后与靶基因上特定的DNA序列（κB位点，其核心序列为GGGRNNYYCC，R：嘌呤Y：嘧啶N：任意碱基）结合并调节基因转录，只要有这段核心序列就行，无种属差异.这是一段通用序列，适用于人、大鼠：5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’老板最近要求做信号转导，所以对NF-KB肯定要好好研究一番。我是菜鸟，所以还需要各位大虾多多指教！我看了各位大虾的帖子，总的来说检测NF-KB的方法有那么几种：1．EMSA：生物素标记的EMSA试剂盒,PIERCE公司，效果好、灵敏，可一天完成整个过程，特别方便。EMSA试剂盒约4000多元，可打8.5折，3500元。最重要的就是核蛋白的质量，基本上就是按说明书操作。EMSA现在有很多种成像方法，除了放射性标记外，还有地高辛等非放射性标记方法。以下两篇文章中还有更多的方法，供参考：>2．免疫组化：免疫组化可以观察NF-kB的核移位情况，但定量较困难，可以用image pro来计数。 3。 western blot：可以测胞浆蛋白IkB，另外，western也可以测核蛋白NF-kB，用p65抗体，但要求核蛋白量较多，意义和EMSA相仿。westerblot测NF-kB,每样本需要20ug就可，有人用的是cell signal的抗体，表达很强。4。可以选用激光共聚焦显微镜，通过荧光动态观察NF-kB的核移位情况，并可通过荧光强度，自动进行计数，很方便。(补充一下，这种方法要用荧光标记的抗NF-kB的抗体)5. ELISA检测P65的活力，不过试剂盒价格很高

我们试验室去年好象买了试剂盒，可看老板意思，是想让我用核酸杂交来做。不知哪位大虾也用杂交做这个，多多交流啊。

转录因子的活性检测可分为检测DNA结合能力和反式激活能力，所以反映其活性应该从这两方面来反应。前者可用EMSA和CHIP方法，后者可用报告基因分析。当然观察其核移位尤其是p65的核移位，可间接地持反映NFKB的活性。收到cfhan文献一篇,希望斑竹能考虑给cfhan加一分,谢谢啊不知道有没有人用过supperarray的NF-KB信号通路基因芯片，效果怎么样？awyang wrote:不知道有没有人用过supperarray的NF-KB信号通路基因芯片，效果怎么样？我估计，这里不是没有是根本没有，哈！beyond2008 你好，我想向你请教EMSA检测NF-KB有关问题： 1、你说的那公司有小包装的试剂吗？至少要3500元吗？能作多少次？你有相关资料吗？能给我一份学习一下吗？我也要作这个东东。 2、你是否还知有比这更便宜一点的试剂吗，但是要用EMSA法。 3、NF-KB好提取吗，我是作淋巴细胞的，这试剂盒内是否有提取用的试剂，我还要再买别的试剂吗？先谢你了，我是没有做过的无知者。carl110 wrote:beyond2008 你好，我想向你请教EMSA检测NF-KB有关问题： 1、你说的那公司有小包装的试剂吗？至少要3500元吗？能作多少次？你有相关资料吗？能给我一份学习一下吗？我也要作这个东东。 2、你是否还知有比这更便宜一点的试剂吗，但是要用EMSA法。 3、NF-KB好提取吗，我是作淋巴细胞的，这试剂盒内是否有提取用的试剂，我还要再买别的试剂吗？先谢你了，我是没有做过的无知者。

呵呵，其实我才是没有做过的无知者！别说请教，一起讨论罢了。这个试剂盒具体情况我也不请楚，你可以咨询做过的战友。我记得有个战友发帖说可以做很多次的，具体你可以再查一下。我找了几篇文献，都是关于NF-KB检测的，我老板的意思是想让我用杂交做这个。我压缩的文件有400多K，传不上，所以我分了两个上传。不过需要说明的是，这都是我匆忙搞出来的，具体你就慢慢看，或者能对你有用。

Nf-kb1.rar (180.21k)

里面的WORD文件是我瞎复制的，你看起来可能有难度，你凑合着看吧

Nf-kb2.rar (246.07k)

这是我总结的NF-kB,边看综述边总结,用了我一整天的时间,其间还竟然发现N多的文献是互相抄袭,惊诧+郁闷中.或许因为我是菜鸟,孤陋寡闻吧.

核转录因子NF-kB是1986年由美国麻省理工学院癌症研究中心的Bltimore和麻省Whitehead生物医学研究所的Rwiansen发现的。他们在成熟B细胞和浆细胞中发现的这种蛋白能与免疫球蛋白k轻链基因增强子的B位点结合,调控免疫球蛋白k轻链的转录,故命名为核转录因子kB。NF-kB广泛存在于真核生物中,是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族。它作为信号传导途径中的枢纽,与免疫、肿瘤的发生、发展,细胞凋亡的调节以及胚胎发育等重要事件有着密切联系,是一种重要的核转录因子。

NF-kB在细胞因子诱导的基因表达中起关键性的调控作用，它调控的基因编码急性期反应蛋白、细胞因子、细胞粘附分子、免疫调节分子、病毒瘤基因、生长因子、转录和生长调控因子等。通过调控多种基因的表达，NF-kB参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤发生等多种生物进程。

有活性的DNA结合的NF-kB是一个二聚体,标准的NF-kB(p50和p65的二聚体)是其中研究最多的。细胞在静息状态下,NF-kB以无活性的潜在状态存在于细胞浆中,它与一种抑制因子IkB结合组成一个三聚体p50-p65-IkB。三聚体中IkB类抑制因子的存在可阻碍p50-p65复合物的二聚体化和使NF-kB的活性丧失。当细胞受到TNF、PMA等NF-kB激活剂刺激时,IkB即从三聚体中解离出来,暴露出p50亚基上的易位信号和p65亚基上的DNA结合位点,从而使此异二聚物表现出NF-kB活性,并从细胞质中易位到细胞核中,与kB基序(kB motif)相结合,从而发挥转录调控作用。初步认为,NF-kB的失活是新合成的IkB进入细胞核中与NF-kB-DNA序列复合体中的NF-kB结合,降低二者的亲合力,使NF-kB从顺式作用元件上解离,新形成的三聚体又回到细胞质中等待重新激活。

原位杂交方法检测NF-kBNF-κB原位杂交试剂盒美国SantaCruze公司有售。采用NF-κB原位杂交试剂盒进行检测,依照使用说明:新鲜配置0.5%过氧化氢/甲醇,室温浸泡30min灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗3次,每次3min;胃蛋白酶室温消化15s暴露mRNA核酸片断,PBS洗3次,每次3min;加预杂交液置入湿盒,38℃恒温箱内放置2h,吸取多余液体,加杂交液专用盖玻片保护,38℃恒温箱杂交过夜,以稀释10倍的柠檬酸缓冲液(SSC)洗4次,每次5min;加封闭液,37℃下放置30min,吸取多余液体,加生物素化鼠抗地高辛抗体,室温下放置2h,PBS洗3次,每次3min;加链霉亲和素生物素复合体(SABC)室温下放置30min后PBS洗3次,每次3min;加生物素化过氧化物酶,室温下放置30min,PBS洗3次,每次3min;DAB显色,光学显微镜下控制反应时间,蒸馏水洗2次,每次3min;苏木素轻度复染,脱水、透明、封片,光学显微镜观察拍照。阴性对照:根据双盲法原则,以PBS液代替探针,其余步骤同上。所测数据以SPSS10.0统计软件包处理,组内用t检验,组间用双因素方差分析。以医学图象分析系统进行图象分析。

有无用原位杂交方法检测NF-KB的战友,一起讨论

近来刚看了一篇关于AKT在TNF-NFkB通路中作用的文献。研究者通过反向阻断，利用westernblot，EMSA和报告基因等技术证明AKT对TNF引起的NFkB的活化是必须的。由此，他们推测在TNF-TRAF-IKK-NFkB基础上，还存在一条平行的TNF-PI3K-AKT-NIK-IKK-NFkB的信号传导通路，两者同时存在才能激活NFkB的反式活化转录的作用。carl110 wrote:你好，我想向你请教EMSA检测NF-KB有关问题：1、你说的那公司有小包装的试剂吗？至少要3500元吗？能作多少次？你有相关资料吗？能给我一份学习一下吗？我也要作这个东东。2、你是否还知有比这更便宜一点的试剂吗，但是要用EMSA法。3、NF-KB好提取吗，我是作淋巴细胞的，这试剂盒内是否有提取用的试剂，我还要再买别的试剂吗？先谢你了，我是没有做过的无知者

据我所知，PIERCE公司的EMSA试剂盒是比较贵的。想省钱不妨试试Promega公司的盒子，打完折大约才2000多点，只不过需要用到放射性探针，但是量非常地小，搞放射的人告诉我说这点儿东东对人体根本就没什么。这种盒子操作起来也非常地方便，大半天即可，说明书也详尽之极。而且其中附带的标准品对熟悉实验方法很管用，建议一用。

非常感谢pcomputer ，你能给我传一点经吗？我是门外汉，先谢了。老板要求用northern-blot检测NF-kB，问大鼠胰腺的mRNA是否好提取？NF-KB探针有何要求？我们实验室一直以来都研究NF－kB的，是老板的专长，我下个月就要做了，也正在学习。我们用的是western的方法，但是，不幸的是师兄留下的抗体据说被污染了，请问大家有知道一抗和二抗分别用什么，哪里有售呢？谢谢！我在努力学习中，会及时和大家交流的。NF-kB Signaling PathwayNuclear factor kB (NF-k is a nuclear transcription factor that regulates expression of a large number of genes that are critical for the regulation of apoptosis, viral replication, tumorigenesis, inflammation, and various autoimmune diseases. The activation of NF-kB is thought to be part of a stress response as it is activated by a variety of stimuli that include growth factors, cytokines, lymphokines, UV, pharmacological agents, and stress. In its inactive form, NF-kB is sequestered in the cytoplasm, bound by members of the IkB family of inhibitor proteins, which include IkBa, IkBb, IkBg, and IkBe. The various stimuli that activate NF-kB cause phosphorylation of IkB, which is followed by its ubiquitination and subsequent degradation. This results in the exposure of the nuclear localization signals (NLS) on NF-kB subunits and the subsequent translocation of the molecule to the nucleus. In the nucleus, NF-kB binds with a consensus sequence (5'GGGACTTTCC-3') of various genes and thus activates their transcription. IkB proteins are phosphorylated by IkB kinase complex consisting of at least three proteins; IKK1/IKKa, IKK2/IKKb, and IKK3/IKKg. These enzymes phosphorylate IkB leading to its ubiquitination and degradation. Tumor necrosis factor (TNF) which is the best-studied activator binds to its receptor and recruits a protein called TNF receptor death domain (TRADD). TRADD binds to the TNF receptor-associated factor 2 (TRAF-2) that recruits NF-kB-inducible kinase (NIK). Both IKK1 and IKK2 have canonical sequences that can be phosphorylated by the MAP kinase NIK/MEKK1 and both kinases can independently phosphorylate IkBa or IkBb. TRAF-2 also interacts with A20, a zinc finger protein whose expression is induced by agents that activate NF-kB. A20 functions to block TRAF2-mediated NF-kB activation. A20 also inhibits TNF and IL-1 induced activation of NF-kB suggesting that it may act as a general inhibitor of NF-kB activation.

NF-kB的经典图片(beyond2008)

为什么上图中的TNF/TNFR途径中的TRAF分子是TRAF6啊？不是TRAF1与TRAF2吗？当然活化NFKB的TRAF分子有TRAF2，TRAF5，TRAF6，但是老外用共沉淀的方法并没有在TNF/TNFR中检测出TRAF6呀？TRAF6可能是参与TNFR家族中其他受体的信号吧。

提个建议：做信号方法中有个很重要的方法就是免疫共沉淀，可以组织大家讨论否？

问个问题：TNF介导十分复杂的信号，有凋亡，有NFKB的活化。NFKB的活化（现在主要的观点）是抗凋亡，而且两者均可通过TNFR1介导。问题是，既然TNF一边启动凋亡，一边又启动抗凋亡，那么细胞是死还是不死呢？如果死或是不死，又是为什么呢？只要TNF作用细胞上的TNFR1就会同时启动两条信号吗？或者其中一条会较另外一条更容易启动，比如所需要的TNF剂量要小些，所需要的TNFR要少些？两条途径哪一条什么时候占优势，有为什么占优势，是由什么决定的呢？因为已知有些肿瘤细胞对TNF有抗性，即抗凋亡，而有些则对之敏感，与之有关吗？

说了很多，真诚希望大家能给点帮助！

我们主要通过EMSA试验和细胞报告基因实验验证NF-kBEMSA试剂都是自己配制的（除了探针合成之外），相对来说时间比较长一些了大家可以多多交流[email protected]miffyqx wrote:我们实验室一直以来都研究NF－kB的，是老板的专长，我下个月就要做了，也正在学习。我们用的是western的方法，但是，不幸的是师兄留下的抗体据说被污染了，请问大家有知道一抗和二抗分别用什么，哪里有售呢？谢谢！我在努力学习中，会及时和大家交流的。

我做过NF-kB的western,用的是SANTA CRUS的P65兔抗，超级好用的说！！！想请教一下，NF-KB的转位，工具药作用后一般在多长时间内发生那？我做的时间点4、8、12、24小时都有，可是按理说转位应该是一个很快的过程啊

garfield cat wrote:为什么上图中的TNF/TNFR途径中的TRAF分子是TRAF6啊？不是TRAF1与TRAF2吗？当然活化NFKB的TRAF分子有TRAF2，TRAF5，TRAF6，但是老外用共沉淀的方法并没有在TNF/TNFR中检测出TRAF6呀？TRAF6可能是参与TNFR家族中其他受体的信号吧。

提个建议：做信号方法中有个很重要的方法就是免疫共沉淀，可以组织大家讨论否？

说了很多，真诚希望大家能给点帮助！

TNF一边启动凋亡，一边又启动抗凋亡：这个应该是有一些蛋白调节的原因，例如最新在nature中2003-2004发表的关于CYLD的蛋白就是一种去泛素酶，与IKK的一个亚基结合，而NFKB释放出来前是有一个泛素化降解IKB的过程，这样NFKB途径抗凋亡得到抑制，可以凋亡。

you can use Luciferase assay check NFkappaB signal学了不少东西，在这里表示感谢，希望获得更多信息学了不少东西，在这里表示感谢，希望获得更多信息请问NF-KB是如何定量的看文献没有定量的全是描述性统计还有就是要做放射性探针是不是要有专门的放射性实验室如何进行防护?中科院上海生命科学院院长裴钢院士及其学生高华、孙悦博士等题为《休止蛋白调控转录因子NF－kB的激活，其调控作用受G蛋白偶联受体的信号调节》的研究论文。该研究首次发现交感神经系统和重要免疫系统细胞信号转导通路间关键的相互作用，揭示了交感神经系统调控免疫系统的一个潜在的分子机制，为将来干预药物的研发提供了可能的靶点和新的思路。据介绍，有许多重要疾病如肿瘤或免疫性疾病，都是由细胞信号转导失误所致。因此，细胞信号转导成为最近十多年来国际生命科学界研究的热点。裴钢院士等研究发现，β2肾上腺素受体信号通路中的一个重要的信号分子――β－arrestin2直接抑制NF－kB的激活，这就抑制NF－kB进入细胞核，无法启动基因表达；同时，β2肾上腺素受体信号还显著增强这种作用。这就首次揭示了β2肾上腺素受体和NF－kB信号通路“对话”的分子机制，而NF－kB在免疫系统中掌管着许多基因的表达，在机体的免疫功能、应激反应、肿瘤发生、细胞的增殖和分化中发挥着中枢功能。NF-kB是一种重要的转录因子，在维持人类健康方面起着重要的作用，例如先天性和获得性免疫就与此有关。所以，核因子- kB的功能失调就会导致多种疾病，包括获得性免疫缺陷综合征（AIDS）、动脉粥样硬化、哮喘、关节炎、癌症、糖尿病、炎症性肠疾病、肌营养不良、卒中以及病毒性感染。最近研究结果还提示：核因子- kB的功能障碍是人类某些基因疾病的一个主要介质。通过遗传因子的变化或者药理学的作用适当的调节和控制核因子- kB的活性，是治疗与核因子- kB相关的人类疾病的方法。以下是信号传导通路示意图（缩略图，点击图片链接看原图）我也支持一下。细胞核因子-kB 是一个多功能核转录因子，最先发现在B淋巴细胞中，其能与免疫球蛋白k轻链基因增强子kB序列(GGGACTTTCC)特异结合，故称之为核因子-kB. NF-kB具有广泛的生物学活性，激活后参与许多基因的转录调控，在感染、炎症反应、氧化应激、细胞增生、细胞凋亡等过程中发挥作用. 近年研究表明NF-kB与细胞凋亡的关系密切.

核因子-kB是一类具有多向转录调节作用的核蛋白因子，存在于多种组织的多种细胞中，具有广泛的生物学活性，激活后参与许多基因的转录调控，在感染、炎症反应、氧化应激、细胞增生、细胞凋亡等过程中发挥作用. 近年的研究表明NF-kB与细胞凋亡的关系密切，其参与多种凋亡相关基因的转录调控，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用. 许多高表达NF-kB的细胞表现出对放疗、化疗、细胞因子介导的凋亡的抵抗作用，而现在又发现NF-kB具有促进细胞凋亡的作用.因而NF-kB与细胞凋亡存在双向调节关系: 既可抑制细胞凋亡，也可促进细胞凋亡. 是抑制凋亡，还是促进凋亡依赖于细胞类型和刺激因素的不同，但具体机制还不十分清楚. 研究其与细胞凋亡的关系，有利于为进一步改善肿瘤的有效治疗提供理论基础.

NF-kB通路在肿瘤细胞抗顺铂中的作用>

qjm7717 报导

有价格优惠的Brdu（sigma)转让,美元比价10.5！！广州的同学需要的话，请QQ:228128960在NF-kB信号转导通路研究中要解决的一个关键问题是：各种各样的内外界刺激通过什么分子机制而汇合到激活蛋白激酶复合体IKK这个NF-kB信号转导通路的主干门路上？我们通过建立依赖于TRAF6的体外IKK激活体系，从真核细胞的胞质部分纯化和鉴定出了Ubc13/Uev1A和TAK1/TAB1/TAB2，它们是NF-kB信号转导通路中关键的信号转导复合体。通过体内和体外的功能分析发现：Ubc13/Uev1A和TRAF6分别是泛肽化系统中新的E2和E3。TRAF6是首列催化以第63位的赖氨酸为分枝位点形成多聚泛肽链的泛肽连接酶。形成的特异构型多聚泛肽链不是作为蛋白可调节性降解的信号，而是通过目前未知的分子机理直接激活蛋白激酶TAK1。活化后的TAK1可以同时激活IKK和MKK6，从而再激活NF-kB和JNK信号转导通路的下游部分。

目前的研究工作有以下几个方面：以K63分枝而泛肽化的TRAF6激活TAK1/TAB1/TAB2蛋白复合体的分子和细胞机理; 泡沫细胞形成和凋亡过程中NF-kB信号转导通路的作用; NF-kB信号转导通路与细胞凋亡通路的互调;病毒对NF-kB信号转导通路的激活。

本人，做过EMSA，但连阳性对照都没出结果，更别提自己的试验结果了。用的是罗氏的试剂盒.NF-kB本身由于可影响的因素太多，而它们这一类转录因子所受到的影响因素有巨多。正像zhoujueyu所说信号转导通路研究中要解决的一个关键问题是：各种各样的内外界刺激通过什么分子机制而汇合到激活蛋白激酶复合体IKK这个NF-kB信号转导通路的主干门路上？单纯研究一个因素对它的影响，我个人觉得没有太大的价值，最好是几个因子一块去做，因为不这样很难搞清谁是因谁是果的？

【本文地址】

NF

NF

今日新闻

推荐新闻