分子克隆:SnapGene最全最详细使用教程 – sci666 |
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分子克隆:SnapGene最全最详细使用教程 – sci666
SnapGene是一款综合性的分子生物学的软件，其包括的功能如PCR，酶切，质粒，载体构建，电泳等等，基本上你用到的，这里都有。
一、SnapGene中的一些工具的介绍
查看质粒图谱：
1.打开一个质粒图谱文件，在Topology option处选择circular，图谱如下：
初始界面
查看序列—点击Sequence，得到如下界面：
1. show enzymes:显示酶切位点，下拉含有多个操作按钮，分别显示序列中不同个数的酶切位点，亦或者显示序列不含的酶切位点，深黑色的是单一的酶切位点，浅色的为多切位点，可快速查询酶及识别序列。
2. show features：显示/隐藏功能序列，某些序列如果含有的功能片段较多，显得较为凌乱，可以点此操作。
3. show translation：显示/预测翻译，显示序列可能的编码区（可下拉调整参数），该功能为预测功能，使用需要结合序列本身的特征或者对序列有一定的了解，也可借助此功能快速预测lncRNA、circRNA等潜在的编码区，十分实用！
4. use 3 letter amino acid codes：显示氨基酸密码子的呈现显示，如Asp—D转换。
三、对片段进项注释
1.给编码序列命名：点击其中一个箭头，按Feature→Add Translated Feature，弹出以下窗口：
Feature：给该片段命名。
Type：选择该片段的类型，右侧箭头代表阅读方向。
Color：选择颜色。
2. 给非编码序列命名：如多克隆位点。先找到质粒图谱中的多克隆位点的第一个酶切位点和最后一个酶切位点。点击 左侧sequence ，找到两个酶切位点之间的序列。
sequence按钮
3. 给质粒图谱增加引物序列：按Edit→Find，输入引物序列，找到质粒序列对应位置，点击Primers→Add primer，弹出该 界面：
四、基于SnapGene软件的多序列比对教程
1 打开SnapGene，直接将txt拖入snapgene起始界面。 2 SnapGene将自动识别txt中的每个序列，并将其拆分成为单独的序列文件，点击“Import”，软件将生成一个文件夹，文件夹中含有txt中的每一个FASTA序列。
3. 用SnapGene打开任意一个序列（推荐打开文件大小最大的），选择Tools菜单栏中的“Align Multiple Sequences”功能（快捷键Ctrl+L）
4. 在弹出的窗口中，将剩下几个序列都选中，点击“打开”，SnapGene将对选中的序列进行多重比对：
5. 比对结果如下图所示，在下方的Map标签页，我们能够看到这几个转录变体同源及非同源区域所在的位置，非同源区域以空白或者三角显示，同源序列以蓝色显示。
6. 点击下方的Sequence标签页，我们能够看到具体的比对结果信息：
7. 我们可以用鼠标选中绿色的区域，复制、粘贴就得到了这几个转录变体的同源序列了。 五、创建新DNA文件 1.打开SnapGene，点击New DNA File，弹出以下窗口：
2.显示如下箭头：
黄色箭头代表的是上面一条链编码序列，绿色箭头代表的是下面一条链编码序列。
3.点击Sequence，点击右侧箭头，选择All 6 Frames，可得到编码序列的所有情况，其中代 表的是终止密码子。
4.添加内含子：根据内含子的位置，点击Edit→Select Range，输入内含子碱基位置。点击 Features→Delete Feature Segment，得到如下图
八、引物、PCR和突变绘制
1.PCR引物绘制：在多克隆位点处找到合适的两个酶切位点。如BamHI和XbaI，在目的基因两 侧截取15-30bp序列，点击Primers→Add primers，选择top strand或bottom strand，如图：
给该引物命名，然后点击Insertion，在该引物上添加之前选择好的酶切位点序列，如图选择了 BamHI，点解Insert：
点击Insertions，选择突变成的氨基酸，点击Insert。即可获得该突变引物，点击Reverse Complement，可获得反向引物。
九、模拟标准限制性克隆
1.打开被插入片段的质粒图谱，选择合适的两个酶切位点，如HindIII和ApaI，如图：
点击Actions→Insert Fragment，点击HindIII+键盘Shift键+ApaI，点击Insert，在source of fragment处选择插入的目的片段来源。点击上述同样的酶，给该重组质粒命名，点击 clone。
十、引物设计及模拟克隆
以pEGFP-C1构建human p53 CDS过表达载体为例，通过酶切位点筛选，选择“EcoRI”和“BamHI”两种内切酶，其中需要注意的是：EcoRI在上游，BamHI在下游 1.按照之前步骤，用snapgene打开p53 CDS序列 2.选择底部“Sequence”页面
3.接下来进行引物设计：首先先选上游前20个碱基
4.点击“Primers”→“add primer”，在弹出的选项框中选择“TOP strand”
5.按下图所示，更改上游primer的名字以及添加酶切位点序列（百度或用snapgene软件打开载体序列均可查找到内切酶对应的切割序列）和保护碱基的序列，然后点击“Add primer to template”
6.然后选择下游20个碱基，点击“Edit”→“copy bottom strand”，选择“5’→3’”
7.然后，点击“Primers”→“Add primer”，在弹出的选项框中点击右上角的×，直接关闭
8.将序列粘贴到序列框中，同理更改名字以及添加酶切位点序列（下游酶切位点是BamHI）和保护碱基的序列，然后点击“add primer to template”
9.点击“Map”，Ctrl键选择两个引物（如图），点击“Action”→“PCR”
10.点击“PCR”，即获得扩增产物（如下图所示）
11.打开表达载体序列，按Ctrl键选择两个酶切位点（蓝色标记的），点击“Action”→“Restriction cloning”→“Insert fragment”
12.点击“Insert”，选择刚刚扩增产物的文件“Amplified.dna”，然后分别输入相应内切酶的名字，点击插入的片段
13.最后在右下角点击“Clone”即可，结果如下
②快捷键“control+R”，添加引物，若引物与序列匹配，会对应到具体位置，对于构建启动子、突变型的序列核实裨益甚大。
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