急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI) 每年导致全世界数百万人死亡, 严重危害人类健康[1]。近年来, 尽管人们已在减少梗塞面积和缺血后损伤以及改善预后方面取得明显进步, 但早期再灌注仍是挽救缺血器官的唯一方法。然而, 对患者至关重要的早期再灌注却会引发严重不可逆性器官损伤, 亦称为心肌缺血再灌注损伤(myocardium ischemia-reperfusion injury, MIRI), 其可增加梗死面积, 加重心肌损伤, 进而导致心功能不全[2, 3]。因此, 如何通过有效途径改善缺血再灌注对心肌细胞的损伤, 已成为当今的热门话题[4]。

大多数研究人员认为, 凋亡是响应MIRI的主要细胞死亡形式[5, 6]。然而, Zhou等[7, 8]研究表明, 另一种有别于凋亡的细胞死亡方式——程序性坏死(necroptosis) 是MIRI模型中细胞死亡主要方式。程序性坏死相关基因缺失可阻止约50%的细胞死亡[9]。程序性坏死而非凋亡将决定MIRI对心脏的损伤程度, 并引发心脏重塑。钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ (calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKII) 在心脏中含量很高, 且其活性过高与心肌死亡有关, 包括MIRI[10]。研究发现, 程序性坏死可通过磷酸化CaMKII的苏氨酸287位点, 导致线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP) 大量开放, 线粒体功能受损, 线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP) 降低, 从而进一步增强CaMKII的活性, 引起心肌细胞膨胀和破裂, 释放内容物, 并引发一系列炎症反应[11, 12]。已有研究表明, 亲环素D (cyclophilin-D, CypD) 作为mPTP的一个关键调节因子, 当其被沉默后可明显减轻CaMKII参与的心肌细胞坏死, 证实了程序性坏死是经由CaMKII磷酸化并通过mPTP开放来执行的[13, 14]。CaMKII介导的程序性坏死有可能为心肌损伤相关疾病治疗提供新的靶点。

田蓟苷(tilianin) 是新疆地产民族药香青兰(Dracocephalum moldavica L.) 的主要活性成分, 属黄酮类化合物, 常用于心、脑血管疾病的治疗, 其中主要通过抵抗氧化损伤和炎症反应发挥显著的抗MIRI作用[15-17]。Jiang等[18]研究结果表明, 田蓟苷可经由线粒体ROS/CaMKII特异性调控途径抑制心肌细胞死亡。但田蓟苷是否通过抑制CaMKII Thr287位点磷酸化导致的mPTP开放, 来保护遭受MIRI的心肌细胞免于程序性坏死还未被证实。因此, 本研究通过采用泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK联合缺氧/复氧(hypoxia-reoxygenation, H/R) 损伤, 建立MIRI心肌细胞程序性坏死模型, 并进而探究田蓟苷保护H9c2心肌细胞MIRI的分子机制。

药品与试剂  田蓟苷(HPLC纯度98%) 由新疆维吾尔自治区药物研究所自制(批号: 20170805), 具体制备方法见文献[19]; DMEM低糖培养基和0.25%胰酶-EDTA, HyClone公司; 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 和无糖DMEM, Gibco公司; 厌氧袋, 日本三菱; Z-VAD-FMK, 美国Selleck公司; Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide, PI), Sigma公司; mPTP开放检测试剂盒, 上海BestBio贝博生物; DCFH-DA活性氧ROS荧光探针、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6检测试剂盒、RIPA (强) 裂解液和苯甲基黄酰氟(phenylmethyl sulfonyl fuoride, PMSF), 北京索莱宝科技有限公司; 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8) 和广谱磷酸酶抑制剂, 美国博士德生物; BCA蛋白定量试剂盒, 美国Thermo Fisher Pierce公司; 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH) 细胞毒性检测试剂盒和SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒, 碧云天生物技术有限公司; 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 试剂盒, 南京建成生物工程研究所; CaMKII、p-CaMKII (Thr287) 和混合系结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL) 抗体, Abcam公司; p-MLKL抗体, Cell Signaling Technology公司; GAPDH抗体、辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG和辣根酶标记的山羊抗兔IgG, 中国中杉金桥公司。

仪器  细胞培养箱和细胞成像工作站Evos FLoid (美国Thermo Fisher公司); 多功能微孔板检测仪(瑞士TECAN SPARK公司); 电泳仪和电泳槽(美国Bio-Rad公司); 多功能成像系统(法国VILBER公司); 台式高速冷冻离心机TGL-16k (湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

细胞株及细胞培养  大鼠心肌细胞(H9c2) 购自武汉普诺赛生命科技有限公司, 培养于含10% FBS的DMEM低糖培养基中。当细胞生长至融合度达80%~90%时, 用0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞, 并将其置于5% CO2、37 ℃培养箱中进行传代培养。

H/R损伤细胞模型建立及分组给药  H9c2细胞随机分为对照组(control组)、Z-VAD-FMK[20]联合缺氧/复氧模型组(model) 及田蓟苷给药组(2.5、5和10 μg·mL-1)。用50 μmol·L-1 Z-VAD-FMK处理24 h, 缺氧缺糖6 h, 复氧复糖3 h, 构建H/R损伤模型, 以此模拟MIRI中H9c2细胞程序性坏死的病理变化, 田蓟苷处理组在缺氧复氧前12 h进行给药。

细胞活力检测  用含10% FBS的DMEM低糖培养基将H9c2细胞调整为1×104个/孔, 接种于96孔板中, 细胞贴壁24 h后, 每组分别加入不同浓度田蓟苷(终质量浓度为0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μg·mL-1), 作用24 h后, 每孔加入10% CCK-8/DMEM混合液100 μL, 置于37 ℃培养箱中孵育2 h。实验同时设立无细胞空白组和有细胞无药对照组, 每组均设6个复孔。酶标仪在450 nm波长处测定各组吸光度值(optical density, A), 并按如下公式计算细胞存活率(cell viability, CV)。

Hoechst 33342/PI双染色法检测细胞死亡方式  使用Hoechst 33342/PI双染色法评估细胞程序性坏死情况。将H9c2心肌细胞接种在6孔板中, 每孔1×105个细胞, 培养24 h, 50 μmol·L-1 Z-VAD-FMK预处理24 h, 加入不同浓度田蓟苷(终质量浓度为2.5、5和10 μg·mL-1) 作用12 h后, 缺氧缺糖6 h, 复氧复糖3 h。PBS洗细胞2次, 并加入Hoechst 33342和PI。然后, 将细胞置于37 ℃恒温箱孵育20~30 min, 荧光显微镜观察并拍照。显示红色和暗蓝色荧光的细胞被定义为程序性坏死阳性。Image J软件计数程序性坏死阳性细胞。

LDH和SOD检测  将H9c2细胞接种于6孔板, 随机分为对照组、模型组和田蓟苷给药组(终质量浓度为2.5、5和10 μg·mL-1), 除对照组, 其余各组均加入Z-VAD-FMK 24 h后, 按照上述分组细胞给药造模, 分别收集细胞培养基上清。按照说明书检测细胞上清中LDH含量(与吸光度成正相关) 及细胞SOD活力。

LDH吸光度=样品吸光度- 背景空白对照空吸光度

ROS检测  将H9c2细胞按1×104个/孔接种于96孔板, 按照上述分组细胞给药造模, 弃上清, 无血清培养基洗细胞2次, 每孔加入100 μL用无血清培养基稀释至10 μmol·L-1 DCFH-DA, 37 ℃培养箱中避光孵育30 min。弃培养液, PBS洗细胞3次以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。每孔加入PBS 100 μL后, 使用酶标仪在激发波长488 nm和发射波长525 nm条件下检测ROS探针荧光强度。

mPTP开放测定  将H9c2细胞接种于6孔板, 同上述5组细胞给药造模, 弃各组上清液, 加入PBS洗涤2次, 胰酶消化后, 每孔加0.5 mL含血清培养液终止消化, 离心, HBSS洗细胞2次, 弃上清。按试剂盒说明书配制BBcellProbe M61染色工作液, 每孔加入5 μL, 并充分混匀, 加入淬灭剂5 μL混匀, 37 ℃避光孵育15 min。1 000×g离心5 min, 弃上清, 用500 μL HBSS重悬细胞, 酶标仪在激发波长488 nm和发射波长525 nm处检测探针荧光强度。

MMP检测  将H9c2细胞接种于6孔板, 同上述5组细胞给药造模后, 按试剂盒说明书配制JC-1 (1×) 染色工作液, 每孔加入1 mL细胞培养液和1 mL JC-1 (1×) 染色工作液, 混匀, 在37 ℃细胞培养箱中孵育20 min。JC-1 (1×) 染色缓冲液洗涤2次后, 加入细胞培养液, 荧光显微镜观察并拍照。

ELISA检测细胞上清TNF-α、IL-1β和IL-6水平  将H9c2细胞按每孔1×105个接种于6孔板中, 同上述5组细胞给药造模后, 收集细胞上清, 1 000×g低温(4 ℃) 离心10 min后, 取上清备用。次日, 选用相应大鼠ELISA检测试剂盒分别检测上清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

分子对接技术  使用Chem3D Pro 14.0软件对田蓟苷进行分子力场优化。从Protein Data Bank数据库中下载相应靶点的蛋白文件, 使用Autodock Vina 1.1.2进行分子对接, 以每个对接结果结合能最低的构象作为稳定构象。运行环境为Ubuntu 18.04 LTS。

蛋白免疫法(Western blot) 检测相关蛋白表达  将对数生长期H9c2细胞接种于6孔板中, 放置在37 ℃、5%的CO2细胞培养箱中培养。次日, 加入50 μmol·L-1 Z-VAD-FMK预处理24 h, 加入不同浓度田蓟苷(终质量浓度为2.5、5和10 μg·mL-1) 作用12 h后, 缺氧缺糖6 h, 复氧复糖3 h。弃细胞上清, 预冷PBS洗涤2次, 加入RIPA (强) 裂解液(含1% PMSF和1%蛋白磷酸酶抑制剂) 冰上裂解30 min。12 000 r·min-1低温离心10 min后, BCA试剂盒测定蛋白样品浓度, 并按比例加入蛋白上样缓冲液, 95 ℃金属浴煮5 min以使蛋白变性。经SDS-多聚丙烯酰胺凝胶电泳后, 电转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭膜后分别加入一抗p-CaMKII、CaMKII、MLKL、p-MLKL和GAPDH, 4 ℃冰箱孵育过夜。TBST洗膜3次, 加入相应HRP标记的IgG二抗室温孵育1~2 h, 用底物化学发光液试剂盒在化学发光成像系统中采图, 得到各蛋白免疫印迹条带, 并用EvolutionCapt软件分析条带灰度。

统计学分析  各项实验至少进行3次独立平行实验, 结果均以x±s表示。数据分析和作图采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA) 进行, P < 0.05认为差异有统计学意义。

如图 1A所示, 0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μg·mL-1田蓟苷作用于H9c2细胞24 h, 对细胞存活率均无明显影响。为了确定田蓟苷对H/R损伤是否具有改善作用, 本研究用Z-VAD-FMK作用于H9c2心肌细胞24 h, 给相应浓度田蓟苷后, H/R损伤。结果发现(图 1B), 与对照组比, 模型组细胞活力明显下降(P < 0.000 1); 与模型组比, 田蓟苷的质量浓度分别为2.5、5、10、20和40 μg·mL-1时, 细胞存活率明显升高(P < 0.001)。上述结果说明, 田蓟苷可改善H/R损伤, 使H9c2细胞活力增强。由于田蓟苷浓度分别为20和40 μg·mL-1时, 细胞活力与10 μg·mL-1组比没有统计学意义, 因此, 后续实验选用的田蓟苷质量浓度分别为2.5、5和10 μg·mL-1。

为了检测田蓟苷对H/R损伤H9c2细胞程序性坏死率的影响, 本实验采用Hoechst 33342/PI双染色法进行细胞染色。程序性坏死的细胞膜完整性在早期已被破坏, 可被Hoechst 33342染成暗蓝色, 而PI染料不能进入细胞膜完整的正常细胞和凋亡细胞中, 因此坏死细胞可被PI染料染色成红色。如图 2所示, 与对照组比, 不加Z-VAD-FMK的H/R组无明显坏死细胞, 而加Z-VAD-FMK的H/R组坏死细胞数明显增多(P < 0.000 1), 说明Z-VAD-FMK可诱导H/R损伤的细胞程序性坏死。与模型组(+ Z-VAD-FMK) 比, 田蓟苷在2.5~10 μg·mL-1范围内可剂量依赖性地减少H9c2细胞坏死率(P < 0.01)。

采用LDH和SOD试剂盒方法评估细胞损伤程度。如图 3A所示, 与对照组比, 模型组细胞中LDH含量显著升高(P < 0.000 1); 而与模型组比, 田蓟苷低、中、高剂量给药组则显著降低LDH水平(P < 0.01), 说明田蓟苷能够减轻或恢复H9c2细胞的H/R损伤。如图 3B所示, 与对照组比, 模型组细胞SOD活性显著降低(P < 0.000 1); 而与模型组比, 田蓟苷高剂量给药组的SOD活性显著上升(P < 0.001)。该结果表明, 田蓟苷能够上调H9c2细胞中的SOD活性。

为了进一步评估田蓟苷氧化应激能力, 本研究以DCFH-DA为探针对H/R损伤H9c2细胞内ROS释放量进行了检测。结果发现(图 4), 与对照组比, 模型组细胞内ROS含量显著升高(P < 0.000 1), 但分别加入2.5、5和10 μg·mL-1田蓟苷后, 细胞内ROS水平较模型组明显降低; 而且, 10 μg·mL-1田蓟苷抑制ROS效果最为明显(P < 0.000 1)。这些结果提示, 田蓟苷可通过抑制ROS释放抵抗H/R诱导的细胞氧化应激反应。

为了评价mPTP开放情况, 本实验先采用BBcellProbeTMM61探针标记细胞, 然后用酶标仪检测其荧光强度。mPTP开放时, 荧光淬灭剂进入线粒体使探针荧光强度减弱, 即平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI) 值降低。结果(图 5) 发现, 与对照组比, 模型组细胞MFI值降低, 则mPTP开放(P < 0.000 1); 与模型组比, 田蓟苷预保护可使H9c2细胞MFI值升高, 表明mPTP被部分关闭。

为了评价线粒体功能, 对线粒体膜电位进行JC-1标记。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。在线粒体膜电位较高时, JC-1聚集在线粒体基质中, 发射光以红色荧光为主; 在线粒体膜电位较低时, JC-1以单体形式存在, 不能聚集在线粒体基质中, 发射光以绿色荧光为主。红绿荧光相对比例常被用来衡量线粒体膜电位变化。图 6发现, 与对照组比, Z-VAD-FMK与H/R诱导的模型组细胞红色荧光向绿色荧光转移, 线粒体膜电位降低(P < 0.000 1); 与模型组比, 田蓟苷预保护可减少红色荧光向绿色荧光转移, 表明线粒体膜电位升高(P < 0.01)。

如图 7所示, 与对照组比, 模型组细胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显升高(P < 0.01); 加入2.5、5和10 μg·mL-1田蓟苷后, 与模型组比, TNF-α、IL-1β和IL-6水平均呈剂量依赖性降低, 且10 μg·mL-1田蓟苷的调节作用最为明显(P < 0.01)。上述结果表明, 程序性坏死能够诱导H9c2心肌细胞发生炎症反应, 而田蓟苷则能部分抑制此炎症反应。

分子对接结果如图 8显示, 田蓟苷上的第5位氧原子可与CaMKII的B链第97位谷氨酸和第140位谷氨酸形成两条较强氢键(2.78和2.93 Å)。第6位氧原子可与CaMKII的B链第20位亮氨酸形成一个弱的氢键(3.02 Å)。第9位氧原子可与CaMKII的B链第93位缬氨酸分别形成一条较强氢键和一条弱氢键(2.68和3.09 Å)。

本研究对CaMKII和p-CaMKII表达进行了检测。结果显示, 与对照组比, Z-VAD-FMK处理后的H/R组细胞p-CaMKII蛋白水平明显升高(P < 0.000 1); 但与模型组比, 田蓟苷预保护可显著下调p-CaMKII蛋白水平(图 9A)。坏死标志性蛋白p-MLKL亦显示类似表达趋势(图 9B)。

缺血性心脏病被视为世界范围内死亡和残疾的主要原因。随着药物生物学和介入疗法的发展与创新, 缺血性心脏病预后得到了显著改善。然而, 心肌缺血/再灌注损伤在临床实践中仍然是一个挑战, 其可增加心肌梗塞面积, 增强心肌纤维化, 并加重心脏功能障碍[21]。目前, 已有研究[22]证实, 田蓟苷对大鼠MIRI具有保护作用, 但缺血再灌注诱发心肌细胞程序性坏死的机制仍不明确。程序性坏死是缺血再灌注损伤诱导的主要死亡方式, 其特征是细胞肿胀, 细胞膜和细胞器破裂, 细胞溶解[23], 且不依赖caspase途径来执行。程序性坏死决定着MIRI对心脏的损伤程度。因此, 本研究通过联合Z-VAD-FMK与H/R损伤建立了H9c2心肌细胞程序性坏死模型, 并且从LDH释放、SOD活性、细胞内ROS释放、线粒体膜电位改变、mPTP开放、Hoechst 33342/PI双染以及蛋白表达等方面证实了该模型的成功构建。同时, 本研究也从以上方面证明了田蓟苷对心肌细胞程序性坏死模型的保护作用。

本实验还通过分子对接技术预测田蓟苷可与CaMKII形成氢键。CaMKII是一种丝氨酸-苏氨酸激酶, 在心肌和其他可兴奋组织中含量很高。在基础条件下, CaMKII倾向于失活; 但当细胞内Ca2+升高时, 可使CaMKII活化, 导致线粒体膜电位去极化, 进而增加心肌细胞死亡[24]。已有研究[14]证明, mPTP是CaMKII坏死途径的关键下游效应物, 其主要调控线粒体功能, 并通过对mPTP开放的影响, 激活多个应激信号进而诱导心肌细胞死亡。据报道[25], MLKL Ser358位点磷酸化标志程序性坏死的启动。因此, 本研究通过检测p-MLKL的蛋白表达水平, 来进一步验证程序性坏死的发生。本研究表明, Z-VAD-FMK联合H/R损伤后, p-CaMKII和p-MLKL表达明显增多, 从蛋白水平证明了程序性坏死已启动, 且细胞线粒体膜通透性转换孔开放明显, 线粒体膜电位降低, 导致线粒体肿胀至破裂, 细胞内容物释放, 并引发周围强烈的炎症反应, 释放炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6; 田蓟苷给药后, 可呈剂量依赖性下调p-CaMKII和p-MLKL蛋白表达水平, 保护线粒体免受损伤, 并减少炎症因子释放, 最终保护心肌细胞免于程序性坏死。因此推断, 田蓟苷可能通过抑制CaMKII Thr287位点磷酸化来适当关闭线粒体膜通透性转换孔, 抑制程序性坏死, 进而对H/R损伤的H9c2细胞产生保护作用。

本研究在前期田蓟苷对缺血再灌注中大鼠心肌保护作用研究基础上, 联合Z-VAD-FMK与H/R损伤建立了心肌细胞程序性坏死模型, 并证实了田蓟苷可能通过调控CaMKII磷酸化水平以及改善mPTP来发挥抗程序性坏死的作用, 为田蓟苷抗心肌缺血再灌注损伤作用提供了科学依据。

作者贡献: 杨洁是本文的第一作者, 负责实验操作及论文初稿撰写; 邢建国和刘砥威为本文的通讯作者, 负责实验设计和把关以及稿件修改等工作; 郑瑞芳负责实验设计; 都研文、李海宁和李少将参与数据分析及讨论。

利益冲突: 本文所有作者声明不存在利益冲突关系。