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提到内参基因，

摆在面前的选择好像就只有

β-actin~GADPH~18S rRNA~

至于为什么要选择这些个内参基因？

回答往往是：Sorry, I don’t care.

有人会说：我师姐就用的这个内参，文献里就是这样写的，能有什么问题？有问题吗？有，而且问题很大。

首先，什么是内参基因呢？

内参即内源性参照，qPCR实验中用于校正因样本量大小或RNA损失等原因导致的基因表达量的变化。如果把基因比作绳子，基因表达量比作绳子的长度，内参基因就像直尺，以它为参照物，我们能更准确地了解绳子的长度。

理想的内参基因应该满足以下条件

不存在假基因(Pseudogene)，以避免基因组DNA的污染扩增；

常用的内参基因通常是各种管家基因（house-keeping genes），管家基因是在所有细胞中表达相对稳定的一类基因，其产物是维持细胞基本生命活动所必需的。如β-肌动蛋白（β-actin）、微管蛋白（tubulin）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）等。

为什么需要使用内参？

通常，做绝对定量时需要制作标准曲线，通过标准曲线来计算初始模板的浓度或者基因拷贝数，这时是不需要使用内参基因的。但是，在做相对定量时，必须使用内参，这是为什么呢？我们可以举一个例子来看一下：

实验目的：检测小鼠胚胎干细胞中A基因相对于普通体细胞中的表达量。

通过qPCR得到小鼠胚胎干细胞中A基因Ct值为20，体细胞中A基因Ct值为21，所以，按照表达量计算公式2-△CT计算，可以得到结论：小鼠胚胎干细胞中A基因的表达量是普通体细胞的2倍。

但是，以上结论成立的前提是：

这显然是无法达成的。

因此，为了将样本处理归一化，引入一个内参进行校正。基于前文对内参基因特点的描述，我们知道内参基因在两类细胞（小鼠胚胎干细胞/体细胞）中的表达量是相对一致的，所以可以对细胞上样量、细胞上样过程中存在的误差、实验过程中存在的实验误差等进行校正。再来看一下引入内参后A基因的表达量：

小鼠胚胎干细胞A基因Ct值为20，内参基因Ct值为15；体细胞A基因Ct值为21，内参基因Ct值为17。所以，内参校正后，按照表达量计算公式2-△△CT计算，小鼠胚胎干细胞A基因表达量是体细胞的1/2倍，结论与引入内参前恰恰相反。

由此可见，若想有效检测一个特定基因的相对表达情况，选择内参进行归一化处理非常重要！

怎样选择合适的内参？

随着对内参基因研究的不断深入，越来越多的常用内参被发现存在缺陷，在不同类型的细胞和组织、细胞增殖和器官发育的不同阶段、体外培养、各种实验条件等情况下它们的表达量会发生重大变化：

因此，选择适合自己试验体系的、特异性稳定表达的内参基因，显得尤为重要。

首先，我们可以通过以下方式获取内参

(1)通过查询相关文献，获取内参；

(2)通过查询数据库，获取内参；

ICG网站：

http://icg.big.ac.cn/index.php/Main_Page

ICG数据库中收集了文献报道的各物种、组织细胞适用的内参基因。比如小鼠的胚胎干细胞对应的内参基因有Pgk1、Sdha、Tbp、Ywhaz和Hk2。

(3)直接选择多个常用内参。

确定了候选内参，接下来就是实验验证

(1)尽可能选用多个内参同时进行验证实验；

(2)通过在不同样本处理中的表达差异检测情况，来选择合适的内参。

总而言之，在相对定量实验中，最重要的是选择合适的内参。而在选择合适的内参中，最重要的，则是保证内参基因在不同处理间的表达稳定性。由于单个内参的表现有时会不稳定，使用多内参也在成为一种趋势。

选择合适的内参基因，你学废了吗？

文章源自：CACLP体外诊断资讯