???? 肾功能异常影响大约10%以上的人口

???? 肾小球滤过屏障(GFB)的破坏导致

    ✔ 肾小球细胞活化、毛细血管闭塞、肾小球硬化

    ✔ 血浆蛋白质漏入肾小球滤液直接伤害肾小管上皮细胞，导致肾小管功能和间质性纤维化

???? GFB损伤主要表现在微小病变和局灶节段性肾小球硬化等疾病中????

???? 现有的肾脏病治疗方案免疫抑制剂、抗高血压药和利尿剂等，取得了部分成功，但仍有限。是否有针对GFB损伤的治疗方案？

01

GFB概述

???? 每个肾小球毛细血管袢形成一个GFB，具有独特的三层结构????

    ✔ 窗孔化的内皮细胞

        ▪ 高度特化的细胞，具有窗孔

        ▪ 内皮腔内表面层具有电荷，也称为“糖萼”，是一种带负电荷的蛋白聚糖、糖蛋白和糖脂混合物，维持电荷选择性屏障

    ✔ 基底膜(GBM)：提供支持内皮细胞和足细胞的物理支架

    ✔ 高密度的具有树枝状交叉指状的足细胞????：形成初级、次级和三级足突

        ▪ 足突通过整合素(integrin)附着在GBM上，进而调节肌动蛋白-肌球蛋白收缩以维持足突交联。初级和次级足突具有复杂的肌动蛋白-肌球蛋白收缩装置和交联蛋白质

        ▪ 裂隙隔膜(slit diaphragm)是一种超微结构分子屏障，连接交叉的足突，包含NEPH1/2、P-钙粘蛋白、原钙粘蛋白FAT1、nephrin和环形同源物 2(ROBO2)。这种分子桥形成了GFB的一部分，并通过CD2相关蛋白(CD2AP)，podocin 与肌动蛋白-肌球蛋白收缩装置连接

        ▪ 外部短瞬态受体电位通道(TRPC)响应各种刺激(包括机械力)而打开，以释放Ca2+调节细胞反应

???? GFB功能障碍

    ✔ 原因

        ▪ 致病蛋白的变异和突变

        ▪ 由环境因素引起，包括外源性、感染、局部免疫蛋白激活或免疫细胞激活、糖尿病环境引起的局部代谢紊乱或肾小球压力升高

    ✔ 内皮细胞

        ▪ 一些导致GFB分解的肾脏疾病，如先兆子痫和溶血性尿毒症综合征，均是直接针对肾小球内皮细胞的因素引起的

        ▪ 人类遗传关联研究结合基因靶向动物足细胞损伤模型，表明内皮特异性一氧化氮合成酶(eNOS)在疾病易感性和严重程度中发挥作用

????图示内皮一氧化氮合成酶(eNOS)缺乏的db/db糖尿病小鼠肾病进展迅速。A尿白蛋白增多，B肾小球滤过率下降

    ✔ GBM成分的异常：例如IV 型胶原蛋白基底膜蛋白的突变和变异

    ✔ 足细胞

        ▪ 损伤最早结构特征之一是足细胞三级足突回缩，减少了足细胞表面积并破坏了裂隙隔膜

        ▪ 持续的足细胞功能障碍导致异常基底膜基质沉积，从而促进小球硬化，最终导致足细胞耗竭

????图示损伤足细胞无法抵消滤过压力，从而使GBM的纤维基质松弛，导致白蛋白的渗透性增加

        ▪ 释放旁分泌细胞因子，血管内皮生长因子A(VEGFA)，与内皮细胞同源受体VEGFR2结合，调节肾小球内皮细胞生长，存活，分化和渗透性

02

GFB的治疗靶点

???? 对于FSGS或SRNS，致病基因大部分涉及

    ①调节肌动蛋白细胞骨架的组装，周转和降解或调节其在细胞表面附着

    ②调节线粒体成分生物合成的蛋白质

???? 目前直接针对GFB并已进入临床试验或处于临床前开发后期阶段的候选疗法大多直接影响线粒体或肌动蛋白-肌球蛋白收缩机制的功能，这是GFB功能的核心

????表对正在进行的针对GFB的药物临床试验总结

03

靶向线粒体功能治疗

???? 线粒体对细胞代谢、体内平衡和应激反应至关重要，其功能障碍与GFB疾病相关

???? 足细胞线粒体病变的病理机制

    ✔ ATP

       足细胞需要大量ATP，通过肌动蛋白细胞骨架来维持三级足突的表面积，线粒体DNA和蛋白质的突变可能导致GFB分解

????图示肾单位特异Cox10(与线粒体功能相关)敲除小鼠导致严重局灶节段性肾小球硬化

    ✔ 线粒体的其他作用：包括ROS产生、细胞死亡、信号通路的整合和对细胞应激的反应

      在FSGS的患者和实验模型中以及糖尿病肾病患者的节段性肾小球瘢痕中，已经报道了肾小球内皮细胞的线粒体氧化应激损伤。内皮细胞的线粒体应激与窗孔和糖萼的丧失有关

???? 尽管关于线粒体GFB健康和疾病中的确切作用还有很多有待了解，但线粒体功能可以作为治疗GFB疾病的靶目标已有多个临床试验

① 载脂蛋白L1(APOL1)途径

  ✔ APOL1编码区的这些常见变异被称为G1(p.S342G:I384M)和G2(p.N388_Y389del)，现在已被确定为肾病发展的遗传风险因素

    ✔ 当两个等位基因都包含一个变异：即G1/G1、G1/G2和G2/G2基因型都具有高风险

    ✔ APOL1的细胞内形式对肾细胞和和足细胞均有毒性

????图示APOL1变异对肾移植患者生存率的影响

????图示足细胞特异表达G1和G2的小鼠会导致肾病

    ✔ 影响足细胞的毒性机制????

        ▪ APOL1遗传变异G1和G2在足细胞膜内和结构中积累，特别是线粒体(插图)，形成寡聚物

        ▪ 作为阳离子孔导致阳离子跨膜泄漏，如K+

        ▪ 寡聚体还与线粒体内膜蛋白结合，激活线粒体通透性转换孔(MPTP)，使线粒体去极化并导致线粒体功能障碍

    ✔ APOL1对肾小球内皮细胞和肾小球以外的血管壁细胞毒性中的作用知之甚少

        ▪ APOL1高风险变异促进高血压肾病的发展和进展，其特征是小动脉血管壁病理以及GFB疾病

    ✔ 两种抑制APOL1毒性功能的疗法正在进行临床试验

        ▪ VX-147，一种APOL1的小分子口服抑制剂(????图)，在FSGS和G1/G1、G1/G2或G2/G2基因型成人的II期试验中(NCT04340362)。该试验的主要终点是第13周蛋白尿的百分比变化

        ▪ ASO，通过全身注射给药，以抑制肾脏中APOL1的产生，目前计划在FSGS患者中评估这种分子

② 辅酶Q10生物合成途径

    ✔ 对于儿童孤立性类固醇抵抗性肾病综合征(SRNS)以及包括SRNS在内的综合征进行的全外显子组测序研究已经确定了超过50个被认为导致GFB分解的基因；绝大多数具有常染色体隐性遗传模式。其中一些聚集在调节亲脂膜成分CoQ10生物合成的蛋白质中

    ✔ CoQ10主要存在于线粒体内膜以及高尔基体和质膜中

    ✔ CoQ10在线粒体氧化磷酸化中起着关键作用，另外由于其氧化还原电位，在线粒体中还具有重要的抗氧化作用

    ✔ 多项研究已将人类突变插入小鼠体内，或特异性破坏小鼠足细胞中的个体COQ基因。足细胞中这些CoQ10生物合成基因的功能丧失导致肾病综合征和FSGS

    ✔ 影响足细胞线粒体的毒性机制????

        ▪ 编码CoQ10生物合成途径组分的基因突变会降低CoQ10的水平

        ▪ CoQ10是内膜电子传递链(插图)的电子受体，导致线粒体功能障碍

    ✔ 临床试验

        ▪ CoQ10和艾地苯醌已经在临床部分使用，但由于CoQ10的亲脂性限制了其向线粒体内膜的转运，因此口服生物利用度有限

        ▪ 中间体2,4-二羟基苯甲酸(2,4-diHB)，亲水性使其具有优越的生物利用度

        ▪ CoQ10或2,4-二羟基苯甲酸(2,4-diHB)可以恢复线粒体内膜中的CoQ10水平(????图)

04

靶向肌动蛋白和肌球蛋白的治疗

???? 在FSGS或SRNS患者中发现了许多参与肌动蛋白-肌球蛋白动力学的蛋白质的突变，这些动力学对于维持GFB至关重要

① 足细胞定向疗法

TRPC6和TRPC5

    ✔ 大约1-2%的FSGS患者有TRPC6突变，其具有常染色体显性遗传模式

    ✔ TRPC6是一种非选择性阳离子通道，可在通过拉伸、氧化应激或包括血管紧张素释放在内的局部因素激活后允许Ca2+进入细胞。Ca2+流入足细胞充当第二信使，调节肌动蛋白-肌球蛋白组装并激活转录因子

    ✔ 影响足细胞的毒性机制????

        ▪ 过度激活的TRPC6或过度激活的TRPC5增加细胞内Ca2+的水平，通过钙调蛋白和钙调磷酸酶激活活化T细胞(NFAT)的转录

        ▪ 细胞内钙激活RhoA(主要通过TRPC6)和RAC1(主要通过 TRPC5和钙调神经磷酸酶)

        ▪ 这些信号事件重塑肌动蛋白以形成应力纤维并破坏正常的肌动蛋白-肌球蛋白收缩装置，导致足突消失、蛋白尿和细胞功能障碍

    ✔ 药物(????图)

        ▪ 高效且选择性的TRPC6通道活性抑制剂，包括AM-1473。但到目前为止，还没有宣布对患者进行临床研究。选择最佳患者群体来评估此类抑制剂可能具有挑战性

        ▪ 小分子GFB-887，可选择性抑制TRPC5。已启动了一项II期篮式研究试验(NCT04387448)，在SRNS、FSGS或糖尿病肾病患者中评估该化合物

抑制可溶性尿激酶纤溶酶原激活剂表面受体

    ✔ 尿激酶纤溶酶原激活物表面受体(uPAR)是一种糖基磷脂酰肌醇锚定受体，可调节纤溶酶原激活。活化的纤溶酶原转化为纤溶酶并在凝块溶解中起作用

    ✔ 裂解为可溶性形式，称为suPAR。suPAR亚型已被确定为候选循环因子，导致肾移植后严重蛋白尿复发的患者的GFB破坏

????图示FSGS复发患者移植前血suPAR明显升高

    ✔ 影响足细胞的毒性机制????

        ▪ 循环suPAR水平升高，特别是含有D2和D3结构域的片段，可以结合并激活足细胞粘着斑处的整合素αvβ3

        ▪ 这种相互作用激活粘着斑激酶(FAK)，其重塑肌动蛋白以形成应力纤维并破坏正常的肌动蛋白-肌球蛋白收缩装置，导致足突消失、蛋白尿和细胞功能障碍

        ▪ 当suPAR是疾病驱动因素时，阻断suPAR与整合素αvβ3结合的抗体是一种潜在的治疗方法

    ✔ 药物(????图)

        ▪ 中和抗体，防止suPAR片段与整合素αvβ3相互作用，但尚未宣布临床研究

        ▪ VPI-2690B是一种阻断αvβ3信号传导的抗体，并已被评估用于保护糖尿病肾病中的GFB。该研究于2017年完成，但结果尚未公布

②靶向足细胞-内皮细胞crosstalk

    ✔ GFB中的细胞之间存在相互依赖性，它们相互配合以维持屏障的结构和功能????

????图示先兆子痫导致内皮增生(左)。内皮损伤也可能导致内皮细胞衍生的促凋亡因子(右)的释放，导致局灶节段性肾小球硬化(FSGS)。在这两种情况下，肾小球滤过屏障都会被破坏。足突融合减少了裂隙隔膜的数量，导致蛋白质泄漏，并最终导致足细胞脱离

ROBO2–SLIT2抑制

    ✔ 在肾小球中，SLIT2和SLIT3是主要来源于内皮细胞和系膜细胞的分泌蛋白，而其受体ROBO2仅表达于足细胞

    ✔ 毒性机制????

        ▪ 内皮细胞衍生的SLIT2激活足细胞中的ROBO2，从而负向调节肌动蛋白聚合和非肌肉肌球蛋白活性

        ▪ ROBO2通过Slit-robo rho GTPase激活蛋白1(SRGAP1)和NCK 和CDC42发出信号

    ✔ 临床试验

        ▪ 蛋白质PF-06730512(????图)是ROBO2和可结晶片段(Fc)抗体域之间的融合蛋白，静脉内给药时会阻断ROBO2与SLIT2的相互作用。目前正在评估PF-06730512在成人FSGS(NCT03448692)的II期临床研究中的活性

抑制内皮素受体A

    ✔ 内皮素1(ET1)是一种有效的血管收缩剂，通过与内皮素A型(ETA)受体和ETB受体结合起作用

    ✔ 在肾小球中，ET1及其受体由系膜细胞、内皮细胞和足细胞表达，并在维持GFB功能具有特定的局部作用

    ✔ 毒性机制????

        ▪ 由于足细胞应激或损伤，ET1从足细胞中释放，内皮细胞上的ETA受体上调

        ▪ 受体激活导致线粒体去极化，从而导致活性氧(ROS)的损伤和一氧化氮合成酶(NOS)的减少

       ▪ 这些变化导致内皮细胞窗孔的丢失和糖萼的降解

       ▪ 内皮细胞释放促凋亡因子，进而导致足细胞纤维形成，并最终导致细胞耗竭

    ✔ 临床试验

        ▪ SONAR III期临床试验在2型糖尿病肾病患者中比较了选择性ETA受体拮抗剂(????图)阿曲生坦与安慰剂，结果显示与安慰剂相比，ETA受体拮抗剂复合肾脏事件的相对风险降低了35% 。但是由于与体液潴留相关的不良事件，试验提前终止

        ▪ Atrasentan正在进行罕见疾病的新III期研究(NCT04573920)

        ▪ 在FSGS中，II期DUET试验发现，在原发性FSGS180患者中，与单独使用ARB治疗相比，sparsentan(一种ETA受体抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂混合剂)可将蛋白尿降低约50%

        ▪ 一项III期DUPLEX试验招募了300名FSGS 患者，其主要终点是估计肾小球滤过率斜率的变化(NCT03541174)。蛋白尿作用的中期分析将于2021年公布

05

针对全身因素:sFLT1

???? 在肾脏中，sFLT1抑制相邻足细胞的VEGFA对内皮细胞上的VEGFR2的激活和信号传导

???? VEGFR2信号传导对于内皮细胞成熟、迁移、维持窗孔和正常内皮细胞功能至关重要

???? 毒性机制????

    ✔ 在先兆子痫中，高水平的sFLT1，一种血管内皮生长因子(VEGF)信号传导的内源性抑制剂，从胎盘释放到循环中

    ✔ 足细胞释放的高水平VEGF，与内皮细胞上的VEGF受体2(VEGFR2)结合，可维持内皮细胞的分化和维持

    ✔ 高浓度的sFLT1“清除”足细胞VEGF并阻断信号，导致内皮细胞肿胀和功能障碍

    ✔ 尽管足细胞足突保持完整，但内皮细胞的糖萼和窗孔被破坏，足以损伤GFB

???? 治疗方案

    ✔ 马萨诸塞大学RNA治疗研究所的学术团队开发了一种新的治疗方法，该方法使用小干扰RNA(siRNA)介导的sFLT1 mRNA沉默来阻止啮齿动物和灵长类动物模型中胎盘产生sFLT1，减轻了高血压和蛋白尿，而不会对发育中的胎儿产生不利影响 

???? 对遗传学、环境损伤而产生的GFB结构、功能改变，已经成为新的肾脏疾病候选治疗靶点

???? 这些靶点选择性地靶向GFB，并提供了定制疗法的可能性，以纠正GFB细胞内或细胞之间的缺陷

???? 然而如何评估这些药物的有效性仍是目前比较棘手的问题，需要选择合适的患者群体进行测试

Ref

1 Nat Rev Drug Discov. 2021 Oct;20(10):770-788

2 Nat Metab. 2020 May;2(5):461-474

3 J Am Soc Nephrol. 2006 Oct;17(10):2664-9

4 Am J Pathol. 2018 Dec;188(12):2745-2762

5 Transplantation. 2016 Jan;100(1):194-202

6 Nat Med. 2017 Apr;23(4):429-438

7 Nat Med. 2011 Jul 31;17(8):952-60

by 肾世风云 · 钟钟