与 Protein A、Protein G 相比，Protein L 具有更广谱的 Ig 结合能力，几乎可结合所有含有 kappa 轻链的 Ig (IgG、IgM、IgA、IgE 和 IgD) 及单链可变片段 (scFv) 和 Fab 片段。谨记根据抗体类型，选择合适的亲和纯化配体 (图 2)。

图 2. 人源抗体与 Protein A、Protein G、Protein L 结合能力对照表

第二关 使用方法选择

MCE Protein A、Protein G、Protein L 琼脂糖，可从血清、细胞培养上清液或腹水中一步分离抗体；Anti-Flag 亲和凝胶 可通过 IP 等方法捕获目的蛋白；链霉亲和素琼脂糖 则可和生物素化样本高效结合。

抗体纯化“大”实验，IP、Pull Down“小”操作，重力柱“大”而离心管“小”焉。杀鸡焉能用宰牛刀，产品详细使用方法奉上 (如下方案仅供参考，详见各产品使用说明)。

■ 重力过柱法，适合从血清等生物样本中分离、纯化抗体。一次实验获得大量抗体，妙！

1）装填：根据样品量取适量的琼脂糖填料加入亲和层析柱，让储存液靠重力流出；

2）平衡：随后用平衡 Buffer 对柱子进行平衡；

3）上样、洗杂：将样品上到平衡好的柱子上后，继续用平衡 Buffer 进行杂质的清洗和去除。

4）洗脱：最后用洗脱 Buffer 将目的样品洗脱。

图 3. 重力过柱，纯化抗体

■ 离心法，适合通过 IP 捕获蛋白或研究蛋白-蛋白间相互作用。精细化操作，稳！

将 Anti-Flag 亲和凝胶吸入离心管，使用离心法操作。离心的方式同样经平衡 → 上样 → 洗杂 → 洗脱四个步骤，前三个步骤 Buffer 的置换通过离心弃掉上清来实现，最后洗脱时离心收集上清。

图 4. Anti-Flag Affinity Gel 的使用步骤

第三关 目的蛋白结合、洗脱

Input 明明有目的蛋白，目的蛋白明明已结合，但洗脱液中却没有目的条带。

巧设对照，巧留样，蛋白洗脱，我在行。

■ 巧妇难为无米之炊，想让我“无中生有”？No Way！

检测结果无条带，也许是以下原因。

PS：设置 Input 对照，确定目的蛋白已表达；保留上样后的流出液/离心后上清液，确定样本已结合。每步操作“留一手”，全面复盘 (分析实验失败原因) 有帮助。

■ “变性”？“非变性”？下游实验应用来决定

1）变性洗脱法 此方法洗脱的蛋白样品后续可直接做 SDS-PAGE 检测，简便、高效。

2）非变性洗脱法 此方法洗脱的蛋白样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。常用的有酸性洗脱法，低 pH 水平可以解离大多数抗体-抗原相互作用。

■ 洗脱后杂带多、纯度低

面对这个棘手的问题，我们首先需要分析杂蛋白的来源：是来自于目的蛋白的降解产物？与填料的吸附？还是与目的蛋白的互作？

1）蛋白部分降解：使用恰当的蛋白酶抑制剂；如对于低 pH 环境很敏感，需在洗脱前的接收管中提前加入中和液。

2）蛋白非特异性结合在抗体、凝胶或离心管壁上，建议对裂解液进行预处理，去除非特异性蛋白；在最后一次洗涤前，将样品转移到新的离心管中操作；洗涤效果不佳，建议增加洗涤时间及次数，增加洗涤 Buffer 中 NaCl 或去垢剂的浓度等。

第四关 WB

这里来抄个作业，3、2、1，上链接我就不信这个邪！打破 Western Blot 玄学操作。

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