图1 拟南芥中pEDR1-EDR1-FLAG和pEDR4-EDR4-GFP的表达Co-IP(Wu et al.,2015)。从4周龄的同时表达EDR1-FLAG和EDR4-GFP的转基因植株中提取总蛋白。以表达EDR1-FLAG和GFP的植株（左图）作为阴性对照。用抗FLAG抗体免疫沉淀EDR1-FLAG蛋白，用抗GFP抗体免疫印迹检测EDR4-GFP或GFP蛋白的存在。

该图为验证蛋白EDR1与蛋白EDR4之间是否存在相互作用的实验结果图。从图中可以看出，蛋白EDR4带有GFP标签，蛋白EDR1带有FLAG标签，并且该实验利用蛋白标签来沉淀和检测EDR1与EDR4蛋白之间的相互作用；该Co-IP实验被分为两组，第一包含GFP标签及EDR1-FLAG蛋白，第二组包含EDR4-GFP蛋白及EDR1-FLAG蛋白；图中共有三组胶图，分别是Input组、IP组以及Co-IP组。

基本情况了解之后，接下来我们开始进行分析：

观察图片的顺序和Co-IP实验操作顺序相同。首先观察Input组，即阳性对照组。第一块胶图为利用抗FLAG的抗体沉淀FLAG标签，发现两组实验都在130kd处有条带，说明两组实验都存在EDR1-FLAG蛋白且其大小为130kd，第二块胶图为利用抗GFP的抗体沉淀GFP标签，发现第一条带在25kd存在蛋白而第二条带在130kd存在蛋白，说明第一组实验存在GFP标签，且大小为25kd，第二组实验存在EDR4-GFP蛋白且大小为130kd。随后观察IP组，该组图表示的是利用anti-FLAG对EDR1-FLAG蛋白进行沉淀，图上显示两组实验在130kd都存在蛋白，说明两组实验的EDR1-FLAG被沉淀下来。最后观察Co-IP组，该组图表示在IP组的基础上进一步利用anti-GFP检测GFP标签，图上显示第一组实验没有条带，而第二组实验在130kd处有蛋白。说明IP组没有把GFP标签共沉淀下来，但是把EDR4-GFP蛋白共沉淀下来了。说明EDR1-FLAG蛋白不能与GFP标签相互作用，但是可以与EDR4-GFP蛋白相互作用，由此可得到结论：EDR1蛋白可以与EDR4蛋白存在相互作用（Co-IP结果如何看？Co-IP（免疫共沉淀）与GST pull-down区别，作者：萝卜卜卜卜卜卜，来源：https://www.douban.com/note/679654399/）。

这里对Co-IP实验结果图中常出现的一些名词进行一个解释，帮助大家更好的理解实验结果图。

Input：关于Input，伯小远想这样给大家解释，假设要验证蛋白A和蛋白B相互作用，那么前提是我们提供的细胞裂解液里要有蛋白B和蛋白A，如果没有，那这个实验就没有意义了。那怎么证明细胞裂解液里有蛋白A和B呢？很简单，直接取细胞裂解液做蛋白A和蛋白B的WB，验证细胞裂解液中确实是有蛋白A和蛋白B就可以了。该过程一般标注Input，也称为阳性对照。

IB：IB即免疫印迹（Immunoblotting），其实可以理解为与Western blot一个意思，就是把分离好的蛋白转移到膜上然后用相应的抗体对其进行检测的方法。

IP：IP即免疫沉淀（Immunoprecipitation），是指利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来。

Co-IP：Co-IP即免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation），是一种在体外检测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。如果两个蛋白在体外能够发生特异性相互作用，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。

图2 免疫沉淀与免疫共沉淀图示。

2.在进行Co-IP实验时，分子量较小的标签蛋白会存在检测不到的情况吗？

会的，在进行Co-IP实验时，有时候用到一些分子量比较小的标签蛋白，例如：His-Tag、Flag-Tag、HA-Tag、Myc-Tag，这些标签蛋白只有几个氨基酸，当它们作为空载对照时，在Input组往往没有对应的条带。为了帮助大家理解，伯小远给大家列举几个例子。

例子一：

上面已经给大家介绍过怎么看Co-IP的实验结果图了，想必这个图大家应该已经会看了吧，如果还有疑问，小远也愿意带着大家一起再简单看一遍哦！

下面这个图的结构看似有点复杂，其实就是纸老虎，从图中我们可以得知该实验是想证明蛋白BAK1与蛋白PUB13之间的相互作用，其中BAK1带有标签HA，PUB13带有标签FLAG。同时，该实验包括4组，前两组（左边两组）为Control，也就是FLAG的空载对照，分为flg22处理（+）和无flg22处理（-），后两组（右边两组）为PUB13-FLAG，同样分为flg22处理（+）和无flg22处理（-），并且这4组都包含了BAK1-HA。接下来我们来看该图片的结构，从下往上看，下面两个图其实就是Input，分别检测FLAG、PUB13-FLAG（下图）、BAK1-HA（中图）蛋白的存在，最上面那个图表示的意思是在免疫沉淀FLAG蛋白的基础上检测HA标签，可以看到右边两组实验都存在条带，因此BAK1与PUB13互作。

最后，回到伯小远给大家列举这个例子的目的上，我们可以看到下图红色方框标出的地方没有条带，因此如果你在做实验的过程中，如果小标签在Input组检测不到，这是比较正常的哦，并不是你的实验出了问题哦。

图3 在Co-IP实验中，BAK1与PUB13相互作用(Lu et al., 2011)。BAK1-HA与PUB13-FLAG或对照载体在原生质体中共表达。用FLAGP抗体（IP：a-FLAG）进行Co-IP，用HA抗体（WB：a-HA）的Western blot进行蛋白分析。（上图）BAK1与PUB13免疫共沉淀。（中图、下图）BAK1-HA和PUB13-FLAG蛋白的表达。用1mM flg22（flg22是一种多肽，细菌鞭毛蛋白N端的一段保守性极高的区域，能够诱导植物天然的免疫反应）刺激原生质体10min。

例子二：

下面这个图的组合有点多，也是看着很复杂，其实也很简单，不过这篇文献作者是将Input放在了上面，IP放在下面，这里不再像上面那样详细解释该结果图怎么看，就简单跟大家解释一下IP组，从图中可以看出IP组分为两个图，上面的图片是利用GFP的抗体去免疫沉淀对应的蛋白，下面的图片则是在免疫沉淀GFP的基础上去检测MYC对应的蛋白，结果发现StVPS52与Mp1相互作用，而不是与MP1的变体相互作用。

举这个例子也是想跟大家说明，分子量很小的标签蛋白作为在Input组一般没有条带（红色方框框出）。

图4 GFP-StVPS52与Myc-Mp1、Myc-Ap1、Myc-Mc1或Myc-Rp1的Co-IPs表明，StVPS52与Mp1相互作用，而不是与MP1的变体相互作用(Rodriguez et al., 2017)。用表达GFP-StVPS52与Mp1及MP1变体的不同组合或GFP载体的农杆菌菌株侵染本氏烟草叶片。侵染3天后，提取蛋白，用GFP-磁珠进行免疫共沉淀，用GFP或FLAG抗体进行免疫印迹。

这里就给大家列举两个例子，关于His-tag和HA-tag没有条带的例子大家可以自己去文献中查找，这里就不再给大家列举了，毕竟自己动手印象才会更深刻哦！

3.IP组免疫沉淀的融合蛋白的标签与空载对照的标签蛋白一定要一致吗？

不一定，上面图3中IP组免疫沉淀的融合蛋白，其标签蛋白与对照空载标签蛋白是一致的（图5中蓝色框所示，其中Control是FLAG的空载对照），很多文献里面确实也都是这样做的，但是也存在不一致的情况，比如上面的图1，IP组的免疫沉淀融合蛋白的标签与空载对照的标签蛋白并不一致（图5中橙色框所示）。两外，上面的图4，对应的标签蛋白都有空载对照，还有的文章直接没有设置空载对照，所以很多东西我们并不能一概而论哦！

图5 上面例子中的图3（左）与图1（右）。

4．GST pull-down与Co-IP验证蛋白互作，利用的都是抗原抗体相结合的原理吗？

不是，Co-IP是利用抗原抗体反应的特异性，但是GST Pull-down一般指用一个带GST标签的重组蛋白，与目的蛋白进行孵育，最后用结合GST的Beads拉下相互作用复合物。

5．做IP/MS实验时，为什么不能跑开条带只送有一条WB条带的去做质谱，而是全部条带打包送质谱？

IP/MS是寻找与目的蛋白互作的潜在蛋白，与酵母双杂筛库的作用差不多，送只有一条WB条带去做实验就相当于酵母双杂点对点验证，并不是筛库，因此，需要将所有条带打包送去做实验。

6. 自己做完免疫共沉淀之后，送样进行质谱，其质谱的送样标准、胶条处理方法是什么？

这里提供3种方法供大家进行选择：

（1）从beads上洗脱下来的蛋白样品直接送样；

（2）不洗脱直接送beads；

（3）直接送SDS-PAGE胶条，但是考染后的胶条脱色一定要脱完全。

7. 做Co-IP或者IP-MS实验时，稳定转基因材料和原生质体/烟草叶片应该怎么选择？

如果实验条件允许，一般是推荐使用稳定转基因材料去做实验，这样能更加准确地反应植物体内真实的相互作用，如果实验条件不允许，例如研究的物种没有稳转体系或者赶时间，就可以选择原生质体或者烟草叶片进行实验。

8.进行Co-IP或者IP-MS实验时，送的新鲜植物样需要多少？

如果蛋白表达量高，送1g样品就足够了，而表达量低的蛋白，送样量就尽可能多一些。

9. IP-MS取样选材标准该如何选择？例如特殊时期、特定组织等。

这个需要根据客户自己的实验目的进行选择，如果客户想要研究开花期蛋白的相互作用，那么取样就需要采开花期的样品。

References：

Lu D, Lin W, Gao X, et al. Direct ubiquitination of pattern recognition receptor FLS2 attenuates plant innate immunity[J]. Science, 2011, 332(6036): 1439-1442.

Rodriguez P A, Escudero-Martinez C, Bos J I B. An aphid effector targets trafficking protein VPS52 in a host-specific manner to promote virulence[J]. Plant physiology, 2017, 173(3): 1892-1903.

Wu G, Liu S, Zhao Y, et al. ENHANCED DISEASE RESISTANCE4 associates with CLATHRIN HEAVY CHAIN2 and modulates plant immunity by regulating relocation of EDR1 in Arabidopsis[J]. The Plant Cell, 2015, 27(3): 857-873.

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