FISH技术方法

荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。

FISH广泛应用于各领域，尤其是基因和细胞领域，随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础，下面介绍下它的发展历程：

1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（FISH）。尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。

1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术。

1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。

下面介绍下如何操作FISH实验的以及各种试剂的配制（绝对干货）：

一 实验目的

通过荧光原位杂交实验，辅助临床医疗诊断：

对肿瘤确诊病人评估预后及中位生存期、无病痛生存期(Dsease-Free Srvival,DFS)，指导用药及治疗方案（针对乳腺癌、胃癌患者的HER-2基因诊断，针对CML患者的bcr/abl融合基因诊断等）。

二 实验原理

利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况

三 仪器设备及耗材

（一） 仪器设备：

①：全自动分子杂交仪

②：荧光显微镜及分析软件

③：恒温水浴箱3个以上（小型号）

④：冰箱2台（提供试剂和标本存放， 4摄氏度和-20摄氏度）

⑤：离心机（用于羊水标本以及血液标本，绒毛标本处理过程的离心）

⑥：通风橱（配固定液，等操作）

⑦：迷你离心机（探针，缓冲液的离心。可离1.5ml管、0.2ml管）

⑧：考普林瓶15个（FISH实验中盛放各种试剂，溶液）

⑨：移液枪（5ml，1000ul，200ul，10ul）放于杂交室和制备室。

10：震荡混匀器

11：计时器，温度计，温度湿度显示器。

12：载玻片盒（用于存放已经FISH实验后的FISH片子）

13：洗耳球，吸量管（10ml）,烧杯，容量瓶，电子天平，常用天平称。

（二） 耗材：载玻片（最好，带磨砂的，写用铅笔患者编号，因为不带磨砂的贴标签会被乙醇洗掉。）

大盖玻片（方形，用于镜检）

小盖玻片（方形或圆形，圆形佳，用于分子杂交时候封片） 离心管（10ml，1.5ml，200ul） 3ml一次性吸管

个人防护用品,标签纸等。

（三）各种溶液的配制

2.1：制NaOH溶液：

a) 用天平称取4克分析纯的NaOH固体，置于一只三角烧瓶中。

b) 用200ml量筒准确取100ml蒸馏水，缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中。

c) 摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解。

d) 然后缓缓倾倒入250ml广口瓶中，密封保存备用。

2.2 ：配制20XSSC溶液：

取氯化钠175.5g和柠檬酸三钠88.2g，加入1000ml双蒸水中，用磁力搅拌棒搅拌，使其完全溶解，用滤纸过滤，调pH为5.3，封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月。

2.3：配制2XSSC溶液：

用20×SSC和双蒸水，按1:9的比例稀释，调pH为7.0, 封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月。

2.4：2×SSC/0.1%NP-40配制 50ml ：

20×SSC(pH 5.3) 0.5ml NP-40 449.5ml 双蒸水 500ml 调pH为7.0 ,封口膜封好，室温保存备用，有效期6个月。

2.5：系列酒精的配制：

取无水乙醇28ml和34ml，分别与12ml和6ml双蒸水混合，配成70%和85%的酒精，与无水乙醇共同组成70%，85%，100%的系列酒精，封口膜封好，室温保存备用；另配制一上述系列酒精，封口膜封好，-20℃室温保存备用。

2.6：PBS缓冲液：

PBS 1L配方（pH7.4）：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g， 磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g， 氯化钠(NaCl)：8g， 氯化钾(KCl)0.2g， 加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。高温高压灭菌后室温保存。

2.7：0.075M Kcl低渗液：

钾5.59g加入1000ml去离子水中溶解（或Kcl 2.794g溶入500ml去离子水中），备用，4摄氏度低温保存。

2.8：固定液：

按甲醇（AR）：冰乙酸(AR)=3:1的比例配制细胞固定液，细胞固定液现配现用。

2.9:1M Hcl：

取.9ml浓Hcl加去离子到100ml混匀，4℃保存备用。保存1个月。

2.10：0.08mg/ml胃蛋白酶工作液：

A：取40mg胃蛋白酶，放入1.5MLEP管中，加1ml去离子水溶解，分装到10个200ul离心管中。 B：次使用时，在考普林瓶中加50ml去离子水，加入500ul1M Hcl，加入一管分装的胃蛋白酶溶液（100ul）。

2.11:200ug/mlPK工作液：

a PK储存液（20mg/ml）：称取0.1g蛋白酶K干粉溶于2XSSC（PH=7.0）溶液中，轻轻摇动，直至PK完全溶解，不要漩涡混匀。-20℃保存。 b 蛋白酶K工作液（200ug/ml）：取0.4mlPK储存液溶于40ml2XSSC（PH7.0）溶液中。

五 实验步骤

（一）：羊水样本FISH实验SOP

一：标本预处理：

①：将新鲜收集到的羊水（10ml）细胞1500rpm离心8min。（转速可调至1500至2000范围内）。

②：去上清，加入5ml0.075M kcl低渗液。混匀，后放入37℃水浴30min。（作用：利用渗透压差使细胞膜破裂，细胞核吸水膨胀。利于探针的杂交。）

③：加入2ml固定液预固定，（甲醇：冰乙酸=3:1），混合均匀后1500rpm离心8min。(固定液中主要利用冰乙酸和甲醇的小分子性，有极强的细胞穿透能力，在瞬间杀死细胞，使细胞固定在低渗后的膨胀状态，保证细胞中需要检测的物质不被破坏。)

④：去上清，加入5ml固定液固定，混合均匀后1500rpm离心8min。

⑤：去上清，加入5ml固定液，混匀后于-20℃保存。

二：样本处理：

①：取出预固定好的羊水标本，1500rpm离心8min。去上清，加适量固定液（10ml的羊水样本，根据细胞的多少，一般留1ML左右的固定液），

②：吹打混匀后吸取少量细胞固定液滴片（滴片前一定要将细胞吹打散开，滴片时保证细胞均匀散开，不要太密集，也要保证有足够计数的细胞）。自然晾干，56℃烤片30min。（防止掉片）

③：将上步所得玻片置于37℃2XSSC溶液中浸泡10min。(洗涤玻片，增加细胞核的通透性，模拟细胞的生理环境，保证细胞被检测物质的稳定性。)

④：将玻片置于37℃40ml胃蛋白酶工作液中15min。（消化细胞中的各种蛋白，增加组织通透性，便于探针杂交）。 ⑤：室温下将玻片于70%、95%乙醇中各脱水2min（梯度脱水）。自然干燥玻片，

三：变性，杂交：

①：室温（暗室）下按探针：缓冲液=2:8的比例配制探针混合物，放入200ul EP管中，充分混匀，离心1-3S.

②：将10ul探针混合物滴于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片，用封片胶封片（保证杂交环境湿润状态。

③准备杂交仪，75℃5min变性，42℃16h杂交过夜。（杂交仪使用前添加去离子水到保湿材料上。）

等二天： ①：用镊子取下封片胶和盖玻片。（如果盖玻片不好下，可以先在2XSSC中浸泡下再去掉）。

②：玻片洗涤（暗室环境）。将玻片于48℃2XSSC溶液中震荡1-3S,漂洗8min。DOUBLE。

③：于48℃0.1%NP-40/2XSSC中漂洗5min。室温下于70%、95%乙醇中脱水各3min。晾干。（NP-40（乙基苯基聚乙二醇）是一种裂解液，去垢剂，非离子表面活性剂，根据浓度不同，作用不同，可以看作是聚乙二醇(PEG)的衍生物，1%浓度时能很好地消化细胞膜，但对核膜没有影响，作裂解液时是一种温和的裂解液，(相对于阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）而言。)）

④：复染：将15ulDAPI加入杂交区（DAPI是一种细胞核染料，能够使细胞核在激发光激发下发出蓝色荧光），盖上盖玻片，20min后于荧光显微镜下观察。

备注：

a 加探针后所有操作均应该在暗室环境下。

b 杂交温度的选择。在37℃-45℃均可进行，选择42℃是因为37℃时杂交灵敏度高，但太多非特异性杂交。45℃杂交特异性高，但灵敏度降低。选择中间42℃比较适宜。

c 在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH的稳定性。所以同样的样本及探针在冬天更应该注意温度的控制，或者适当延长浸泡洗涤及消化时间。

d 直标型探针和间标型探针有何不同？为什么我们要选择直标型探针？所谓的直标型探针是指DNA探针共价连接着荧光素基团；间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团，类似“三明治”的复合物。与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性的特点。

e 在多数情况下，如果FISH操作没有得到正常的结果，我们可以将探针洗去，然后使用同样的探针进行再次的杂交。

f 0.1%NP-40/2XSSC洗涤非特异性杂交信号时，也洗掉没有杂交上的探针。

g 用于实验的2 X SSC、.01NP-40/2 X SSC洗液、胃蛋白酶工作液、0.01M Hcl、固定液、酸性亚硫酸钠和蛋白酶K工作液不可反复使用。

（二）：血液样本FISH实验SOP

一：样本预处理：

①用移液器取取2ml血液（抗凝血）（最好24小时内处理）（血液样本根据检测项目的不同，病灶部位的不同，临床医生抽取患者不同部位的血，如：检测MM：抽取骨髓血，检测CML(慢性粒细胞白血病)，抽取外周血。加入10ml离心管中，加入5mlPBS缓冲液，洗涤，1500rpm离心8min。（在模拟细胞生理环境下对细胞进行洗涤。）

②：去上清。加入5ml低渗液，37℃孵育20min，期间吹打细胞2-3次。（使红细胞破裂）

③：加入2ml固定液，预固定，1500rpm离心8min。

④：去上清加入固定液，反复固定、离心至固定液颜色由深变浅。-20℃保存。

二：样本处理：

①：将细胞固定液1500rpm 8min。去上清，加入适量固定液，滴片。

②：自然晾干，56℃30min烤片。

③：于37℃下2XSSC中洗涤20-30min。于胃蛋白酶工作液中洗涤8min。2XSSC中洗涤5min 2次。

④：（暗室）探针：缓冲液=2:8，加探针于杂交区，盖片，封边。

⑤：78℃变性5min。42℃16 h杂交过夜。

等二天（暗室）： ①用镊子取下封片胶和盖玻片。（如果盖玻片不好下，可以先在2XSSC中浸泡下再去掉）。

②玻片洗涤（暗室环境）。将玻片于48℃2XSSC溶液中震荡1-3S,漂洗8min。DOUBLE。

③于48℃0.1%NP-40/2XSSC中漂洗5min。室温下于70%、95%乙醇中脱水各3min。

④甩干后自然晾干玻片，向杂交区加入15ulDAPI，盖上大盖玻片，（DAPI是一种细胞核染料，能够使细胞核在激发光激发下发出蓝色荧光），盖上盖玻片，20min后于荧光显微镜下观察。

（三）：石蜡组织样本FISH实验SOP

一：样本预处理：

① 将组织切片置于65℃下过夜烘烤，老化玻片。

②将组织切片浸泡于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10min。（或置于一瓶二甲苯中脱蜡 20-30min）。随后浸入100%乙醇中5min。（无水乙醇洗涤二甲苯）。

③：将组织切片依次室温100%、85%、70%乙醇中各2min（梯度复水）。

④：将切片放入去离子水中90℃孵育30min。（或者：50℃下用30%[w/v] 酸性亚硫酸钠（sodium bisulfite ）处理组织切片20－30分钟。）（去除核酸表面的蛋白质，增加组织的通透性，利于探针的杂交）。

⑤：取（3.2mgX3=9.6mg）胃蛋白酶加入40ml0.01M hcl得胃蛋白酶工作液。37℃孵育25-30min。（亦可用200ug/mlPK10min代替,虽PK工作液的时间短，但容易消化过度。）

⑥：于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5min。

⑦：将漂洗完的玻片浸入放有2.5%甲醛的PBS缓冲液中（1ml甲醛加入39ml的PBS缓冲液中）中10min（*此步骤可以省略，不影响信号质量，而且甲醛为高毒性物质。故一般不用。）。

⑧：将玻片一次置于70%、95%乙醇中各2min，自然晾干玻片。

⑨：按探针：缓冲液=2:8配探针混合物，将10ul探针混合物滴于玻片杂交区域，加盖小玻片，封片。于杂交仪上82℃变性5min，杂交过夜。

二：洗片： ①：去掉封片胶和盖玻片，于46℃（46-48℃）水浴2XSSC溶液中5min，Double。

②：将玻片置于46℃0.1%NP-40/2XSSC中，晃动1-3S，5min后取出。

③：70%、95%乙醇中脱水各2min。

④：甩干，自然干燥。

⑤甩干后自然晾干玻片，向杂交区加入15ulDAPI，盖上大盖玻片，（DAPI是一种细胞核染料，能够使细胞核在激发光激发下发出蓝色荧光），盖上盖玻片，20min后于荧光显微镜下观察。

备注：a 冬季脱蜡时间延长， b 根据切割组织样本的厚度不同，以及样本组织的不同，消化时间适当增减。