含GFP或标签蛋白的重组蛋白的选择 |
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构建外源基因通常有两种方案，一是目的基因接绿色荧光蛋白（GFP)或红色荧光蛋白（RFP），二是在目的基因上带一个标签蛋白（如His或Flag等）。 GFP重组蛋白： 1、GFP蛋白分子量比较大，如与目的基因形成融合蛋白也许会影响目的蛋白的功能，其优点是便于观察。 2、GFP，CFP，YFP tagging：适合于观察 蛋白在细胞内的定位，不适合用于一般的蛋白实验，因为本身大小都在25kda左右，而且这样的荧光质粒的蛋白表达量，相比要小一些。 含标签蛋白的重组蛋白： 1、标签蛋白通常只有几个氨基酸，其与目的基因结合一般不会影响目的蛋白的功能，而且市场化的标签抗体可用来检测外源基因的表达或纯化。 2、His, Myc, Flag, HA 标签： 由于本身大小只有 2kda左右，不会影响蛋白作用，而且，一般所选用的promotor也比较强，蛋白表达量也很多，足够一般的任何生物实验，一般用于蛋白相互作用等试验。一般不能用于定位。 3、推荐：sigma --> Flag, santa cluz--> HA 注：参考丁香园相关网站汇总。 HIS标签： 主要应用：His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究 优缺点：1.标签的分子量小 2.可在非离子型表面活性剂存在/变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用； 3.可应用于多种表达系统，纯化的条件温和； 4.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 5、免疫原性相对较低； Flag-tag标签： 主要应用： 广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域，在真核表达系统中表达效率更高。 优缺点：1.其通常不会与目的蛋白相互作用，便于研究人员对融合蛋白进行下游研究。 2.其目的蛋白，可直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 3.其可以被抗FLAG的抗体识别，便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。 4.融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。 GST 标签： 主要应用：GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。 优缺点： 1、它是一个高度可溶的蛋白； 2、它可在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。 3、在大多数情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二体。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。 c-Myc 标签： 主要应用：应用在 Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。 含11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。 荧光素酶标签： 主要应用： 常用于研究启动子、miRNA 3'UTR克隆的功能与调控 优缺点： 1.灵敏度高，检测幅度宽； 2.不是哺乳动物细胞内源性基因； 3.重复性好； 4.与HTS兼容等。该如何选择表达克隆的标签 1、首先，需要确定融合标签的目的 蛋白纯化 ：标签的普遍用途是蛋白纯化。小分子6XHis Tag常被用于细胞内源蛋白的纯化。6XHis Tag也广泛应用于大肠杆菌的蛋白纯化。可是哺乳动物细胞中因非分泌蛋白自身存在高组氨酸背景，因此极少使用6XHis Tag。 Western Blot检测：若需要做Western Blot实验来检测细胞裂解物中蛋白的表达，你可以选择有匹配的抗体的小分子标签。FLAG® Tag以其分子量小以及拥有许多与之匹配的商业化的抗体等优势，成为Western Blot实验中常用的Tag。 免疫沉淀反应：FLAG® Tag其分子量小以及拥有大量相匹配的商业用抗体等优势成为免疫沉淀反应中最常用的Tag. 其他常用的标签有：HA和cMyc. 活细胞成像：荧光蛋白（Fluorescent Proteins, FPs）是活细胞成像常用的标记蛋白。其中最常用的是绿色荧光蛋白（GFP）和它的衍生物（CFP, YFP, etc.），以及一些红色变体，如dTomato和mCherry.2、考虑融合标签的影响 任何一类标签处于氨基酸序列的任一位置，都具有影响目的蛋白表达或功能的可能性。最主要原因是标签可能会干扰蛋白的正确折叠，致使目的蛋白失活或形成包涵体。其次，标签可能会中断亚细胞定位信号，这种情况下，蛋白能够正确翻译和折叠，但在细胞内所处的位置是错误的。因此，您需要知道添加的标签对目的蛋白的表达是否有影响。 3、考虑是在N-端还是C-端标记 N-端或C-端标记的选择还需要根据蛋白结构、定位等特性。然而，倘若你没有确切的蛋白结构，或蛋白功能域图谱，建议分别构建N-端标记和C-端标记的表达克隆，以检测哪个更有效。 参考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/29096502 |
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