目前有很多研究都开始运用Cas9文库进行大规模筛选，在拿到感兴趣的基因后，再进行下游的功能机制研究。之前常规的研究套路大致如下：准备好感染文库病毒的细胞后，在该细胞中加入合适浓度（比如IC20）的某个药物，该药物会导致细胞死亡，后续测序分析哪些基因的敲除或者过表达会抑制或促进这种细胞的杀伤作用。

但是，对于文库病毒的应用其实远不止于此。近期在Cell发表的一篇文章1，加入药物Tunicamycin会诱导细胞ER（内质网） stress响应，不过此时细胞依然能够正常生长。但是在敲除部分基因导致ER stress响应被抑制后就会影响细胞增殖。通过这个方法，作者筛选到了TMEM2基因，后续证明了其在ER stress中的作用，并发现过表达该基因能够明显延长线虫寿命。

我们其实也可以设计其他的筛选试验来进行longevity的筛选研究，比如在感染文库病毒细胞中加入某个促进细胞衰老的药物（或者其他物理因素），然后通过一些衰老相关marker，细胞流式分选衰老细胞和未衰老细胞，从而发现哪些基因促进衰老，哪些基因抑制衰老。

近期有两篇应用Cas9文库筛选的高分文章，他们的筛选方式都有很好的借鉴之处，下面我们就具体看看他们的研究思路是怎样。

Cas9文库筛选在分化研究上的应用

2020年3月发表在《Cancer Discov》的题为《Global Regulation of the Histone Mark H3K36me2 Underlies Epithelial Plasticity and Metastatic Progression》文章2再次为我们拓宽了Cas9文库病毒筛选的视野。

背景介绍

肿瘤细胞具有高度的细胞可塑性，其细胞表型和功能可以随着生长环境发生巨大变化。上皮间充质转化（Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）以及其相反过程（MET），是被最广泛研究的细胞可塑性事件之一。该事件主要发生在胚胎发育形态发生阶段，但在肿瘤发生发展过程被重新激活。大量的研究已证明EMT与肿瘤转移及更低的预后有着直接的关联。EMT过程包含许多上皮样蛋白的表达抑制，如E-cadherin、Occludin等，及间充质样蛋白表达的诱导。

表观遗传调控可以在全基因组水平大规模地改变整个转录组的表达。这种整体水平表观遗传的改变已被报道和许多细胞命运决定相关，尤其是在正常的胚胎发育阶段。目前已有的EMT与表观遗传相关的研究更多地集中在已知的EMT相关基因启动子和表观遗传因子的相互作用。之前的研究也报道了在EMT过程中基因组水平的DNA甲基化及部分组蛋白修饰的变化情况，但是这些表观遗传变化是否足以诱导EMT这个问题仍然未得到解决。

研究材料

该研究利用了多株胰腺导管腺癌小鼠模型分离的单克隆细胞株，这些克隆株同时包含有上皮样及间充质样细胞亚群。为了确认这种亚群是否是固定的，通过流式将上皮样细胞亚群（Ecad+）或者间充质样细胞亚群（Ecad-）分离后继续培养，可以发现，这些细胞具有相互转化的能力（图1）。该结果说明，在正常培养条件下这些细胞株具有动态的细胞可塑性（上皮样和间充质样可相互转化）。

图 1

实验结果

研究者利用3077 c4这株细胞，通过CRISPR/Cas9文库筛选鉴定EMT过程中起重要作用的表观遗传因子，针对约600个表观遗传因子进行了CRISPR/Cas9的KO文库筛选。感染Cas9文库病毒之后，在不同时间点，收集细胞，流式分离Ecad阳性细胞和阴性细胞，通过测序分析其中不同sgRNA的富集程度（图2）。最后发现，靶向Nsd2的sgRNA在Ecad阳性细胞中有非常高的富集。相反地，靶向Kdm2a的sgRNA在Ecad阴性细胞中有非常明显的增加。Nsd2是H3K36me2的甲基转移酶，而Kdm2a是H3K36me2的去甲基化酶。文章后续做了一系列的实验证明了Nsd2-Kdm2a轴对H3K36me2的调节在EMT过程发挥着重要作用。

图 2 CRISPR/Cas9 文库筛选流程

文章亮点

从对cas9的应用来看，本文就有很多值得借鉴的地方。第一，对Cas9文库的应用跳跃到对“基因-分化”的筛选，而非局限于“基因-药物-增殖”的框架。这启示着我们，如果有合适的细胞或者动物模型，许多的分化过程可以通过用文库病毒筛选以获得和该分化过程相关的基因，而且这个文库可以聚焦到到一个很特定的基因群而非进行全基因组筛选。第二，调节的双向性的认识。在首先发现了靶向Nsd2的sgRNA在Ecad阳性细胞中明显增加之后。作为同为调控H3K36me2甲基化的其他基因需要受到关注，因此发现了靶向Kdm2a的sgRNA在Ecad阴性细胞中增加，这也进一步暗示了H3K36me2在EMT过程中的重要地位。

Cas9文库筛选在

联合用药杀伤肿瘤上的应用

2020年4月发表在《nature genetics》的题为《Using antagonistic pleiotropy to design a chemotherapy-induced evolutionary trap to target drug resistance in cancer》文章3，将文库病毒筛选应用到了联合用药领域。

背景介绍

所有的群体都面临着选择性压力，因此群体会向着适应这种压力的方向上进化，在这个进化过程中会获得某些特性。一旦环境快速变化，之前获得的特性在新环境中表现出不适应性，就会导致整个群体从原有的适应性转变为适应不良，从而导致进化陷阱。假定环境变化足够突然以避免产生新的适应，并且不适应性足够大，进化陷阱完全可以导致族群的灭绝。癌症，作为一种容易产生药物抵抗的疾病，原则上容易受到这种陷阱的影响。这个概念可以被用于多种化疗药物协同治疗肿瘤。第一种药物治疗后产生抵抗，从而出现进化陷阱。通过第二种药物启动该陷阱，消灭肿瘤细胞。

目前已有部分研究发现，一些初始疗法产生的耐药性会对第二种种疗法更加敏感。但是，这种耐药性向敏感性转化背后基因层面是如何进行调控的，仍未被有效发掘。

实验材料

该研究利用OCI-AML2细胞系，在感染cas9文库病毒之后，分别用ABT-199，selinexor，JQ-1，quizartinib，vorinostat，cytarabine，mitoxantrone，decitabine，azacitidine这9种药物进行处理。（图3）

图 3

实验结果

文章将功能缺失后增强药物作用的基因定义为sensitizer（s），将功能缺失后削弱药物作用的基因定义为resister（r），将功能缺失后不影响药物作用的基因定义为inert（i）。如果一个基因在一个药物中是sensitizer，而在另外一个药物中是resister，则认为该基因具有拮抗多效性（antagonistic pleiotropy，AP）。在这两个药物中，这个基因则被定义为AP基因。

在该Cas9筛选试验中，作者得到了非常多的AP基因。那么如何判断哪个AP基因具有更广泛的影响呢？可能一个AP基因只在筛选8个药物中的两个起作用，而另外一个AP基因可能在8个筛选药物中的4个起作用。显然，至少从结果看，后者具有更高的研究价值。因此，作者定义了一个AP系数（API），即一个基因在不同的药物中分别可能是sensitizer，resister，inert（图4）。将这种基因在不同药物中的作用比作一张小卡片。每次从这堆卡片中抽取一张，直到抽取的卡片中有一张sensitizer和一张resister，计算抽取的次数。由于这种排列有很多的组合，最后计算平均值，即API。从原理来看，如果一堆卡片中如果inert很多，sensitizer和resister很少，则API值会很大。同理，如果sensitizer很多，resister很少，API值也会较大。只有当sensitizer和resister均比较多的时候，API会较小。API越小，说明该基因作为AP基因的潜力越大。通过这套理论，作者发现了EZH2（API=4.2）和EED（API=3.9）这两个PRC2复合物基因（前15%AP基因，AP