磷酸化蛋白的磷酸化特异性抗体流式细胞仪使研究人员可以快速、有效地测量单个细胞中的信号级联。改进的基本免疫荧光染色和流式细胞仪方案可用于通过流式细胞仪同时分析表面分子和细胞内磷酸化信号蛋白。通常，细胞用甲醛固定以稳定细胞膜，然后用去垢剂或酒精透化，使得抗细胞内抗原的抗体可以在细胞内进行染色。

Invitrogen eBioscience 磷酸化流抗体及相关缓冲液体系均通过以下所示方法进行了严格检测，帮助科学家们确信其按预期运行。

首先，我们已验证在诱导不同通路的细胞组合中，我们仅在激活了特定感兴趣通路的细胞中看到磷酸化特异性染色。

其次，我们验证了磷酸化特异性染色只在表达蛋白的细胞类型中观察到，而不是在不表达蛋白的细胞类型中。 在通路和细胞类型特异性实验中检测抗体有助于让最终用户对他们从我们这里购买的抗体的特异性感到放心。

不处理小鼠脾细胞或用抗小鼠 IgM、u 链特异性抗体或过钒酸钠激活。然后，用 anti-CD3（T 细胞）和 anti-B220（B 细胞）对细胞进行表面染色并使用抗磷酸化 BTK/ITK (M4G3LN) PCP-eFluor 710 进行细胞内染色。直方图显示 CD3+ 门控 T 细胞（左）和 B220+ 门控 B 细胞（右）上的磷酸化 BTK/ITK 水平。橙色 = 未刺激，紫色 = +a-IgM，绿色 = +Na3VO4。

不处理 Daudi B 细胞（顶部）或 Jurkat T 细胞（底部）（橙色直方图）或用过钒酸钠处理（紫色直方图）。然后，使用抗磷酸化 BTK/ITK (M4G3LN) APC（顶行）或竞争对手的 pBTK/ITK Alexa Fluor 647（底行）对细胞进行细胞内染色。实验表明 M4G3LN 克隆可同时看到 BTK（B 细胞）和 ITK（T 细胞），而竞争对手的 mAb 只能看到 BTK。

第三，如果可能，使用蛋白质免疫印迹确认已刺激/处理细胞（而非未刺激/未处理细胞，视情况而定）内存在相应大小的条带。另外，如果可能，我们视情况使用通路抑制剂以验证我们观察到信号增强或减少。

不处理 Jurkat T 细胞或使用 P+| +/- MEK1 抑制剂处理。蛋白质免疫印迹显示 pERK1/2 信号。直方图显示相同条件下的 pERK1/2。黑色 = 未处理，绿色 = PMA+iono，红色 = PMA+iono+MEK 抑制剂。这些数据显示了  蛋白质免疫印迹和流式细胞仪对特异性的验证。

用 10 ug/mL MIgG1 同种型纯化对照品（左）和 10 ug/mL 抗人 NF-kBpS529 (MFCA30)（右）染色的 FFPE 人乳腺癌组织的免疫化学分析。使用苏木精对细胞核进行复染。NF-kBpS529 位于导管上皮细胞的细胞质和细胞核上。

每个磷酸化特异性抗体已经在三种不同的流式细胞仪缓冲液体系中进行检测：IC 固定与透化、Foxp3/转录因子缓冲液和 IC 固定缓冲液/甲醇。将在每种特定抗体的技术数据表上注明推荐的缓冲液体系。由于甲醇可能会破坏某些抗体识别的抗原决定簇，因此，在使用耐甲醇荧光染料（如 eFluor 450、FITC 和 eFluor 660）的方案开始时进行表面染色比较理想。但是，请理解由于抗体结合导致细胞活化，在刺激前进行表面染色可能产生不良影响。因此，我们建议在刺激/处理、固定和甲醇处理后染色。请参阅我们的表格（固定/透化后的抗体克隆性能），以评估基于甲醇的缓冲液体系中许多克隆的性能。

未处理 Jurkat T 细胞（红色直方图）或用 H2O2活化的过钒酸钠在 37°C 下处理细胞5分钟（蓝色直方图）。 然后，分开细胞并在 室温下使用 IC 固定缓冲液固定10分钟，然后用透化缓冲液透化（左）， 使用 Foxp3/转录因子缓冲液在室温下固定和透化30分钟，然后用透化缓冲液透化（中）或用 IC 固定缓冲液在室温下固定10分钟，然后在冰上用冰冷的 90% 甲醇透化30分钟（右）。 然后，使用 eBioscience 的 pZAP-70/SYK（克隆 n3kobu5）单克隆抗体（顶行）或竞争对手的 pZAP-70/SYK 单克隆抗体（底行）进行细胞内染色，然后进行流式细胞仪分析。

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