FAQ: 引物的合成和纯化

2023-10-09 01:12| 来源: 网络整理| 查看: 265

1. 引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，由待合成引物的3'端向5'端合成延伸，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下：

用三氯乙酸去除固相载体5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，与游离的5'-羟基发生缩合反应；由于无法保证百分之百的5'-羟基都参与缩合，可能有极少数5'-羟基没有参加反应（少于2%），可用乙酸酐和1-甲基咪唑试剂将其终止合成，这种短片段可以在纯化时分离掉；在氧化剂的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更稳定。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸就被连接到固相载体上。重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基连接完成。合成过程中可以监控脱下的保护基团DMT的颜色可以初步判定合成效率。

2. DNA合成粗产物中含有什么杂质？

主要是合成过程中产生的少量失败片段。

3. 引物纯化方式有哪些？

目前引物常用的纯化方式有：C18脱盐、RPC纯化、ePAGE纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。

表1. 引物纯化主要方式的介绍

纯化方式详细说明 RPC纯化 RPC纯化是通过反相净化滤芯（Reverse Phase Cartridge）对引物进行纯化，纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较，RPC是一种有效且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如C18的硅胶，能够很好的吸附DNA，并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、 PCR及基因合成等。 ePAGE纯化 ePAGE是利用特异性吸附全序列，去除产品中短序列及杂质的方法，凭借自动批量进样，纯化等设备，更高效的完成DNA的纯化。纯度可满足大多分子生物学实验需求，如qPCR、多重PCR、定点突变、RNA干扰（基因构建）、质粒DNA测序、全基因合成、PCR克隆等。ePAGE凭借自动化，时间短，通量大的特点，以更低的价格和更短的交付周期，提供与PAGE相近纯度与质量的产品。 PAGE纯化 PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对引物DNA进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于90%，对长链Oligo DNA（大于50mer）的纯化特别有效。 HPLC纯化 HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对引物DNA进行纯化。该方法用于分离纯化或分析时能达到很高的纯度和灵敏度。在引物DNA的分析和纯化中，常用的有离子交换（ion-exchange）HPLC和反相（reverse-phase）HPLC。reverse phase HPLC：纯度大于90%；ion exchange HPLC：纯度大于95%，可以有效的去除N-1短片段。HPLC纯化主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的缺点是成本较高，批量生产效率不高。 4. 引物纯化方式如何选择？

金斯瑞采用RPC、ePAGE纯化、PAGE、HPLC四种纯化方式，在选择上主要根据引物的长度和应用方面对纯度的要求而定，表2即从引物长度的角度总结了以上每一种纯化方法的适用范围。您可根据实验需要，选择合适的引物纯化方式。如您需要进一步的指导，请联系金斯瑞技术支持。

表2. 引物纯化主要方式的适用范围及建议

纯化方式引物长度建议适用范围

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