AAV 属于微小病毒科，呈二十面体结构。病毒基因组为线状单链DNA，长度约4.7 kb，其中包含两个 开 放 阅 读 框 ， 分 别 编 码 调 节 蛋 白 Rep(Rep78、 Rep68、Rep52 和 Rep40)及结构蛋白 Cap(VP1、VP2、和 VP3)。 基 因 组 两 端 为 反 向 重 复 序 列 (inverted terminal repeat，ITR)，对病毒的复制和包装具有决定作用，也是重组腺相关病毒(recombinant adenoassociated virus，rAAV)包装复制所必需的自身结构。目前已分离出13种天然血清型(AAV1-AAV13) 和上百种AAV变体，不同的血清型具有不同的组织趋向性[8] 。AAV血清型、启动子、注射方式以及注射量都是影响AAV病毒感染效率的重要因素。中枢神经 系 统 疾 病 中 常 用 的 有 AAV1、 AAV2、 AAV5、AAV7、 AAV8、 AAV9、 AAVrh10、 AAV-PHP. eB等。血脑屏障的存在对中枢神经系统有很强的保护作用，但同时它也能阻隔药物的传递和吸收，给神经系统疾病的治疗带来难题。既往中枢神经系统疾病基因治疗的研究多采用鞘注、脑实质注射或脑室注射等，随着研究人员进一步改造AAV衣壳，发现 AAV9、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB、AAV-PHP.S、AAV.CAP-B10 等可以通过静脉注射高效穿越血脑屏障，实现全脑表达，且AAV.CAP-B10在全脑高表达的同时不在肝脏富集，避免了可能引起的肝毒性等副作用。安全有效的载体递送系统是基因治疗成功的关键，如何提高 AAV 载体的安全性、特异性、转染效率和生产能力等是目前研发的重点。

目前AAV介导基因治疗的临床试验主要集中在神经肌肉病、溶酶体病、神经退行性病、眼部疾病和血液系统疾病。以AAV为载体的基因治疗药物目前有6种获 批 上 市 ， 分 别 为 用 于 治 疗 SMA 的Zolgensma、治疗AADC缺乏症的Upstaza，治疗脂蛋白酯酶缺乏症的Glybera，治疗RPE65基因突变相关视网膜营养不良的 Luxturna，治疗血友病 A 型的Roctavian，以及用于治疗血友病B型的Hemgenl，其中治疗 SMA 的 Zolgensma、治疗 AADC 缺乏症的Upstaza 是目前 FDA/EMA 批准的用于儿童神经遗传罕见病的AAV介导的基因治疗药物(见表3)。这些药物的获批上市也进一步推动了AAV介导的基因治疗在神经遗传罕见病中的研究应用。

近年来，AAV 介导的基因治疗在杜氏肌营养不良(duchenne muscular dystrophy，DMD)、脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy，SMA)等神经肌肉病中 有了突破性的进展。目前的基因治疗产品药物研发以体内增补为主，基因编辑较少。2019年5月，美国FDA批准了诺华公司的基因疗法 Zolgensma，用于治疗 2 岁以下 SMA 患者，2022 年 1 月该药通过中国国家药监局药品审评中心临床试验许可。Zolgensma是目前首个也是唯一获得批准用于治疗SMA的基因疗 法，是一种基于AAV9载体的基因疗法，单次静脉注射给药，通过载体引入人 SMN1 基因，透过血脑屏障，直接增加体内SMN蛋白的表达，长期改善患者生活质量，临床研究数据显示安全性及有效性，但在部分患者中出现的不良反应不容忽视，2022 年两名儿童在接受Zolgensma治疗后死于急性肝功能衰竭，一名儿童出现了嗜血细胞性淋巴组织细胞增多症，推测可能是高剂量的药物导致了肝脏毒性。国内自主研发的SMN1基因增补治疗EXG001-307注射液(CXSL2200146)的临床试验获得中国国家药品监督管理局药品评审中心批准，成为中国境内首个被批准进入注册临床试验的静脉注射Ⅰ型SMA的基因治疗产品。该产品对AAV载体进行了创新设计，目的在于降低对心脏和肝脏的副作用以更好的发挥疗效；随后 CG101AAV 注射液临床试验申请获得 CDE 受理，进入临床试验阶段。DMD的基因治疗进入临床应用阶段，针对基因治疗的递送方式也在不断改进，主要经历着从物理递送、非病毒载体递送、病毒载体递送到组织特异性病毒载体的发展过程。关于AAV介导的DMD基因治疗的注册临床试验有 10 余项(clinicaltrials.gov & clinicaltrialsregister.eu)，主要研究策略包括：“终止密码子通读”、“外显子跳跃”、“载体介导的基因替代治疗”、“基因编辑治疗”。由于DMD基因外显子数量庞大，为已知的人类最大基因(2.4 Mb)，而AAVv载体容量仅约4.7 kb，目前有研究通过双重腺相关病毒技术和慢病毒载体提高基因载体的容量，有望装载全长的DMD基因。Sarepta、Pfizer和Solid公司主要致力于DMD基因疗法的开发，且都开发了AAV递送小型DMD 基因的疗法，现处于Ⅱ期或者Ⅲ期临床试验阶段。前期部分研究数据显示基因治疗的安全性及有效性，但在临床试验PF-06939926中，一个失去独立行走能力的患者在参加Ⅰb 期临床研究后死亡，Ⅲ期临床试验中也有3名受试者出现肌肉无力、急性肾损伤和血小板下降，多在给药最初几周发生。 近 年 成 簇 而 规 律 地 间 隔 短 回 文 重 复 序 列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)技术有了广泛应用，通过注射rAAV包装的Cas9核酸酶和gRNA，可以恢复抗肌营养不良蛋白表达以及肌肉收缩能力的改善，表明CRISPR-Cas 系统可以用于纠正导致 DMD 的多种遗传突变，并为永久纠正DMD提供了潜在的基因治疗前景。Tabebordbar等开发了一种靶向肌肉的的 新型AAV载体即MyoAAV，其具有特异性靶向肌肉细胞、治疗剂量较低，可减轻肝毒性等特点，其出现进一步推动了AAV在神经肌肉病中的应用。

溶酶体病(lysosomal storage diseases，LSDs)常累及多个器官和系统，70%的患者有显著的中枢神经系统症状。血脑屏障的存在限制了酶替代疗法在LSDs患者的疗效，AAV介导的基因疗法在动物实验和临床试验中都表现出显著的优越性和安全性，在儿童庞贝病、黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis，MPS)、神经元蜡样脂褐素沉积症(CLN2、3、6、7)、异染性脑白质营养不良、神经节苷脂贮积症、戈谢病(I型、II型)等中开展了多项临床研究。目前已注册的 AAV 介导的庞贝病基因治疗临床试验有 10 余项，其中针对儿童患者的有8项注册临床试验，主要为美国佛罗里达大学和中国锦蓝生物科技有限公司开发药物(GC301)，分别使用AAV1、AAV9血清型载体，通过肌肉注射、静脉注射方式进行基因替补治疗(见表 1 和表 2)。前期研究数据显示，通过麻醉后胸腔镜辅助下膈肌AAV1-CMV-GAA注射给药的，可改善晚发型庞贝病患者的呼吸功能，数据显示该研究是安全、有效的，锦蓝基因开发的GC301静脉注射基因治疗的临床研究数据有待进一步更新。在MPS患者中AAV介导基因治疗的临床研究主要集中在MPS I、II、III、VI型患者，儿童患者中共计注册10 项 临 床 研 究 ， 采 用 血 清 型 AAV9、 AAV2/6、AAVrh10、AAV2/5，通过脑室注射、静脉注射、脑实质注射方式进行基因治疗。目前有四项3期临床研究(三种基因治疗药物)目前正在进行患者招募。前期部分研究结果显示，在MPS I型、II型患者中治疗耐受性良好，无严重的治疗相关不良事件，治疗后患者酶活性改善，较自然病程相比患者神经认知水平有一定程度改善。

癫痫和发育性癫痫性脑病是新致病基因发现的重点领域，尽管抗癫痫发作药物不断研发上市，但仍有25-30%的癫痫患者为药物难治性。癫痫领域在基因治疗的临床研究及应用上远远落后于神经肌肉病、溶酶体病和其他遗传罕见病。特别是离子通道基因变异导致的癫痫及发育性癫痫性脑病，涉及复杂的基因功能改变，包括功能获得型、功能丧失型、功能获得和丧失型，让基因替代治疗变得较为复杂。SCN1A 基因变异导致的 Dravet 综合征是遗传性癫痫的代表，由于 SCN1A 基因较大，含有 26 个外显子，而且 SCN1A 基因在体外复制时容易产生新发变异，稳定性较差，在大肠杆菌感受态扩增SCN1A质粒时每次扩增均需要进行测序，因此通过 AAV 递送SCN1A 基 因 受 限 。 ETX101(AAV9-REGABAeTFSCN1A)是一种靶向 GABA 能抑制性神经元的基因疗法，通过 AAV 递送 SCN1A 特异性转录因子(eTFSCN1A)和GABA能调节元件，以增强SCN1A在受影响的抑制性神经元中的表达水平，发挥抗癫痫作用。杂合 Dravet 小鼠经侧脑室单次给药后，小鼠的存活率、热性惊厥发作的阈值升高且自发性癫痫发 作 次 数 减 少 ， 现 已 进 入 Ⅰ/Ⅱ 期 临 床 试 验 阶 段 (NCT05419492)。此外，仍有其他AAV基因疗法在Dravet综合征的动物实验中展示出有效性，如通过脑室注射 AAV9 载体递送 NaVβ1，或静脉注射 AAVPHP.eB 载体递送 CRISPR/cas9、gRNA，均可以改善小鼠表型。CG01 是一种基于 AAV 的基因疗法，目前处于临床前实验阶段，可 以 将 神 经 肽 Y (neuropeptide Y ，NPY)及其受体Y2递送到脑内特定区域，稳定表达，且没有发现对认知和体重的不良反应。相信越来越多癫痫相关基因治疗临床研究的开展会改变诊疗模式，为药物难治性癫痫的治疗带来新希望。

AAV 介导的基因治疗策略在其他神经遗传罕见病中也有较好的应用前景。如芳香族 L-氨基酸脱羧酶(aromatic L-amino acid decarboxylase，AADC)缺乏 症，目前有多项临床试验在招募或已完成，针对儿童AADC缺乏症患者，主要选用血清型AAV2，采用脑 实 质 注 射 进 行 基 因 治 疗 。 2022 年 7 月 PTC Therapeutics 公 司 AAV 基 因 治 疗 药 物 Upstaza (eladocagene exuparvovec，PTC-AADC)已获得欧洲药品管理局上市批准，成为首款通过脑定位注射进 行患者给药的基因治疗药物，同时也是第一款获得上市批准的用于治疗 18 个月以上 AADC 缺乏症的AAV 基因治疗药物。Ⅰ/Ⅱ期临床试验(NCT01395641) 结果显示，患者治疗后耐受性良好，可在一定程度上改善患儿运动发育。2023年3月，上海交通大学医学院注册了一项新的临床试验，采用血清型AAV9，通过双侧壳核注射进行VGN-R09b药物基因治疗，目前该研究正在招募阶段，这也是国内首个针对 AADC 缺乏症患者开展的基因治疗临床研究，研究结果有待后续更新。近年来AAV介导的基因治疗在多种儿童神经遗传罕见病中开展了临床前及临床试验，随着技术的发展，不同细胞类型特异性的AAV载体的研发，如对少突胶质细胞趋向性更强的AAV 变体 AAV/Olig001，可以克服常用 AAV 血清型难以靶向少突胶质细胞，对海绵状脑白质营养不良等遗传性脑白质病的治疗瓶颈问题。同时，AAV介导的神经追踪和疾病造模推动了儿童神经遗传罕见病致病机制的阐明，为其防治奠定了基础。

AAV 载体在临床上有诸多的应用优势，但也存在一定的局限性，这给AAV的临床应用带来了很大的挑战。包括降低免疫原性、提升细胞/组织靶向性、 优化可携带的基因容量限制、降低生产成本、扩展适应症等。AAV病毒是一种外源性抗原，尽管免疫原性低，仍有引起机体相应的免疫反应，产生中和抗体，甚至是细胞毒性反应的风险。一系列临床试验严重不良事件的报道让研究人员对AAV介导的基因治疗的安全性有了更高的要求。虽然理论上AAV载体为非整合型病毒载体，其导致细胞基因组发生插入突变的风险相对较小，但仍有在特定情况下载体整合至基因组的报道 ，部分产品的基因修饰活性可使细胞的遗传物质或生物学特性发生不可逆的改变。

基因治疗通过引起人体的永久或长期的变化达到治疗效果，这些变化在体内长期存在，可能增加不可预测的风险如迟发性不良反应、长期表达、潜伏再激活、持续感染、基因编辑活性、非预期的生物分布、基因重排或重组、免疫原性等，包括可能增高的肿瘤风险。因此，需要建立规范的监管体系以及健全的长期随访制度，评估治疗的有效性、安全性及长期预后。挑战与机遇并存。随着基因治疗研发和上市脚步的加速，中国成为全球基因治疗药物临床试验注册热点国家，更多国内外公司已将中国作为推出其原研产品的首发市场，而此前传统药物通常是在美国、欧盟或日本首发。基于基因治疗产品临床试验的特殊性，早期临床试验通常采用Ⅰ/Ⅱ期融合试验设计，在罕见病药物快速审批流程的推动下，获得良好安全性的研究将会迅速推进至注册临床研究Ⅱ期或Ⅲ期。例如Zolgensma先后获得了该药审批的快速通道、突破性疗法、罕见儿科疾病治疗药物、优先审评等相关资格认证，极大的缩短了审评时间。

目前， 国内多个领先的临床科研团队蓄势待发，多项AAV介导的基因治疗已经注册或者进入临床试验阶段。临床研究规模的不断扩大，有助于国内研究团队成 为收集诊治数据的首个触点，积累基因治疗实战经验。同时，相关支持性的政策环境将进一步加速整个基因治疗生态圈的形成。随着针对罕见病的优惠医保政策出台，也为儿童神经遗传罕见病诊治提供了重要基础条件。基因治疗的发展进步也为更多遗传性疾病的治疗带来希望。

文献来源

王晓乐,林雪芹,贺海兰等.腺相关病毒介导的基因治疗在儿童神经遗传罕见病中应用的现状与展望[J/OL].中南大学学报(医学版):1-10返回搜狐，查看更多