1、1基因诊断和基因治疗2概念：基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定DNA序列。 基因的改变，会导致各种表型的改变，进而引起疾病的发生。 将基因或其组成部分发生异常的疾病统称为基因病。 3基因病分为三大类：一、单基因病：由单个基因突变引起的一类疾病。 如：血友病、地中海贫血等。 二、多基因病：由多个基因突变综合作用引起的 疾病。 如：恶性肿瘤、高血压、动脉硬化、糖尿病、先天畸形等、三、获得性基因病：指外源基因（DNA）侵入，在机体产生疾病，一旦将其清除便可痊愈。 如：艾滋病及各种微生物成形成与其他逆转录病毒相同，但较之复杂，故称复杂反转录病毒HIV属反转录病毒即单链RNA反转录成双链DNA，进入宿主细胞染色体。 40非典型性肺炎（SARS）由一种新型冠状病毒（SARS-CoV）引起，多种途径传播，传染性强、高致死率的急性疾病。 诊断依靠：流行病学、临床表现、放射诊断、血清学（荧光免疫、ELISA）PCR作为一种灵敏的早期病原学诊断必不可少（关键是引物的合成）412、在遗传病检测中的应用 产前诊断 检测妊娠812周的绒毛DNA或羊水细胞 PCR诊断一系列遗传疾病 镰刀状细胞贫血的诊断 方法：RFLP诊。

2、感染病。 4第一节 基因诊断（DNA diagnosis）一、基因诊断的概念和基本概况临床诊断生化学诊断免疫学诊断临床疾病诊断四种方式：以疾病表型改变为依据。 （细胞形态结构变化、代谢产物异常、特定蛋白分子识别差异等）基因诊断对患者基因直接分析5基因诊断定义（概念）：基因诊断是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测患者体内基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断或辅助诊断。 基因诊断是在DNA/RNA水平检测分析基因的存在、结构变异和表达状态，与传统诊断方法比较有其特点：6基因诊与HIV病毒艾滋病由HIV通过接触、血液、血制品及母婴传播感染所致。 HIV特异地侵犯辅助性T细胞（CD4），引起人体细胞免疫严重缺陷，导致顽固的机会性感染，恶性肿瘤和神经系统损伤。 HIV 感染后，95%感染者5个月可检出抗体（也有3-4年仍不能检出抗体）。 有必要进行PCR技术检测。 39艾滋病与HIV病毒检测技术：巢式-PCR、Southern、DNA序列分析引物的设计：应在保守区（基因：pol,env,gag,tat)病毒特点：HIV病毒由两条单链RNA组成，9.7k/RNA，主要基因结构和组。

3、断的特点：1、病因诊断：直接瞄准病理基因，不仅对表型出现的疾病作出诊断，还可能发现潜在的致病因素，如:确定有遗传家族史的人携带致病基因。 2、特异性强、灵敏度高：选用特定基因序列作为探针，单拷贝基因采用高度扩增PCR技术。 3、稳定性高4、诊断范围广，适应性强目的基因是否处于活化状态均可。 样品可长期保存。 可检测正在生长的病原体或潜在病原体。 （与以疾病表型改变为依据的 诊断技术相比）7基因诊断的基本概况：伴随分子生物学理论技术的发展而建立和发展。 DNA双螺旋 遗传密码破译 DNA重组 癌基因与抑癌基NA片段中有碱基突变.357、基因芯片 将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测根据杂交分子和未杂交分子信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。 基本原理：（生物集成模片、DNA阵列、或寡核苷酸微芯片）36基因芯片技术：37目的：检测外源性基因的侵入目标：1、微生物2、病毒 如：HIV（致艾滋病 AIDS）3、寄生虫、4、不易体外培养的病原体（毒性大肠杆菌、麻风分枝 杆菌）5、实验室培养的病原体（克立氏体）四、基因诊断的 临床应用:1、在感染性疾病检测中应用38艾滋病。

4、因研究 地中海贫血病基因治疗和逆转录病毒载体开发 PCR、分子杂交等一系列技术发展8二、基因诊断的对象1、病原生物的侵入病原体：病毒、支原体、细菌、寄生虫检查诊断方法：显微镜、免疫学方法、基因诊断等。 尤其是当无抗体时，基因诊断成为唯一手段。 2、先天遗传性疾病遗传性疾病:发病的原因为特定基因的突变。 9肿瘤的发生：发病机理尚不请。 初步认为是个别细胞基因突变而引起的 细胞无限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）3、后天基因突变引起的疾病二、基因诊断的对象10（1）用核心顺序的串联重复序列组成探针进行杂交研基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常 敏锐地将构象上有差异的分子分离开.PCR-SSCP34PCR-SSCP基本过程PCR扩增靶DNA将特异的PCR扩增产物变性后快速复性;将单 链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显 色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该D。

5、 究，可同时检出具有高度多态性位点。 （2）用southern 杂交得到DNA指纹图谱个体识别、亲子鉴定、法医物证4、其他二、基因诊断的对象遗传稳定，个体特异，因而用于法医和亲子鉴定。 11基因诊断的基本策略：1、检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因 这些基因根据其特定功能已被克隆，并被定位在染色体上，基因序列亦被测定，致病时的基因改变亦较清楚。 如：已被克隆的病毒、细菌、霉菌和寄生虫的基因、与致病有关的癌基因、抗癌基因、地中海贫血、苯丙酮尿症等遗传病基因。 122、检测与某种遗传标志连锁的致病基因特异的寡核苷酸（ASO）方法：1、合成两种探针：已知突变位点的核苷酸序列（M）正常基因碱基序列（N）2、杂交实验结果：M+N-受检者是突变基因的纯合子 M-N+受检者是不存在突变基因M-N-受检者的缺陷基因可能是一种新的突变类型M+N+受检者是突变基因的杂合子原理：已知基因突变部位和性质，合成基因特异的核苷酸探针（20bp），标记后与受检者DNA杂交诊断。 （可与PCR联用：PCR-ASO）336、单链构象多态性（SSCP）日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，当有一个碱。

6、遗传连锁同一染色体相邻的二个或二个以上的基因或限制性酶切位点，由于位置十分靠近，在遗传时分离几率很低，常一起遗传-称连锁。 染色体遗传连锁图用限制性内切酶酶切位点作遗传标志，定位与之相连锁的正常基因与致病基因，建立相应的遗传连锁图谱。 定位性克隆根据遗传连锁图进行定位性克隆。 比较正常和异常基因的差别，可找出导致遗传病的分子缺陷。 定位性克隆策略是当前基因诊断的重要基础。 133、检测表型克隆基因针对多基因病（如：重度肥胖、哮喘、高血压、癫痫、精神病、多种自身免疫性疾病）。 表型克隆技术是将有关表型与基因片段多态性。 31AFLP原理：首先利用可产生粘性末端的限制性内切酶酶切研究对象的基因组序列，产生不同长度的酶切片段。 然后，将这些酶切片段与含有与其有共同粘性末段的人工接头连接，形成模板。 为达到选择性扩增的目的，再在模板末端添加具有选择性核苷酸（13个）的不同引物，然后PCR扩增，结果只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。 最后将被扩增的片段在高分辨率的测序凝胶上电泳，这样其多态性即根据扩增片段的长度与数量的不同而被分开。 PCR扩增产物即等位片段之间差别只有几个bp。 325、等位基因。

7、结构结合，直接分离该表型的相关基因，并对疾病相关的一组基因进行克隆，然后用作多种探针，来诊断多基因遗传病。 该策略既不需预先知道基因的生化功能或图谱定位，也不受基因数目及其相互作用方式的影响。 方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和异常基因组寻找两者之间的差异序列2、基因组错配筛选技术：寻找两者的全同序列，分离、鉴定与疾病相关的基因，确定导致疾病的分子缺陷14基因诊断的基本步骤：1、获得待检样品：提取核酸（PCR提高灵敏度)2、制备和标记核酸探针3、基因检测分析 15三、基因诊断的常用技术l 核A片段差异，称限制性片段长度多态性（RFLP）。 人类基因组中由中性突变导致个体间核苷酸的差异称DNA多态性29RFLP类型：2、由于链内发生较大片段的缺失、重复、插入和重 排导致DNA顺序的变化，因而酶切片段改变 序列多态性。 1、单个碱基的突变引起酶切位点的变化 点多态性致病基因附近或内部一般存在RFLP,可用于连锁分析的基因诊断。 30（四）扩增片段长度多态性（AFLP）应用于基因突变性质不明的连锁分析。 AFLP串联重复的短片段的长度多态性通过PCR扩增,经限制性内切酶酶切后电泳,产生显示扩增。

8、酸分子杂交l 聚合酶链反应（PCR）l 限制性片段长度多态性（RELP）l 扩增片段长度多态性（AFLP）l 等位基因特异的寡核苷酸（ASO）l 单链构象多态性（SSCP）l 基因芯片161、核酸分子杂交原理：利用核酸的变性、复性及碱基互补的性质，用已知基因的核酸序列作探针，与变性后的单链基因组DNA/RNA杂交，检测核酸样品中是否存在与探针互补的同源核酸序列，进行DNA或RNA定性定量分析。 基因检验的两个必要条件：1、必需的特异探针（标记的）2、必需的基因组DNA17核酸分子杂交核酸印迹杂交定量 PCR：借助特异性结合DNA的荧光染料，实时动态检测PCR扩增的DNA量的变化。 27其他重要的PCR衍生技术反向PCR（IPCR）标记引物PCR（labelled primers PCR）锚定PCR（anchored PCR）差异展示PCR（DD-PCR）（见书“分子生物学技术”章节）283、限制性片段长度多态性（RFLP）检出方法：Southern 印迹概念：用同一限制性内切酶完全切割同一物种的不同个体的基因组DNA，出现分子质量不同的同源片段，这种由限制性内切酶酶切位点变化导致的DN。

9、l DNA印迹杂交（Southern blot）l RNA印迹杂交（Nouthern blot）l 斑点印迹杂交（Dot-blot）l 原位杂交(situ hybridization)18核酸印迹杂交基本过程：提取DNA或RNA 酶切 凝胶电泳 胶变 性处理（DNA）转印核酸片段到NC膜上。 （RNA可直接用变性胶电泳，转膜）1、制备样品：19核酸印迹杂交基本过程：（2）制备探针：探针：一段能和待检测核酸分子按碱基互补配对 原则而结合的核酸分子片段。 探针需要标记可直接检测的元素或分子。 如：同位素苷酸序列。 用于检测特定基因片段的存在，分析鉴定基因突变。 以总RNA或mRNA为模板，逆转录为cDNA后扩增。 用于检测特定基因表达水平的主要方法之一。 （3）、PCR-SSCP：检测基因未知突变的常用技术。 简单、快捷、灵敏。 26（4）、多重 PCR：指在一次PCR反应中加入多对引物，同时扩增DNA序列上不同序列片段的一种PCR技术。 用于一些“超大”基因中大片段缺失分析。 （5）、原位 PCR：直接用组织切片和细胞进行PCR或RT-PCR，在组织、细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特点基因序列。 （6）、实时。

10、荧光、生物素等20核酸印迹杂交基本过程：核酸印迹杂交可检测pg水平的靶分子（4）检测：方法依标记的探针而不同*放射性同位素*生物素*地高辛*荧光素（3）杂交：预杂交封闭非特异性结合位点 杂交探针与核酸分子结合21核酸印迹杂交基本过程：222、聚合酶链反应（PCR)原理：以待扩增DNA为模板，在互补模板两端序列的寡核苷酸引物介导下，通过耐高温DNA聚合酶催化下，按半保留复制机制延模板链延伸，快速、特异地扩增特定的DNA。 一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术。 （无细胞分子克隆技术）。 23耐高温DNA聚合酶Taq酶寡核苷酸引物：设计引物和确定退火温度是PCR 成功的关键。 PCR的基本过程：（循环程序）变性（95）退火（5565）延伸（72）35分401分100bp/1分源自水栖高温菌，最适反应温度为72，且经90以上加温后仍可在温度恢复后复性。 24（呈2n 扩增速度）PCR基本过程和原理特点：特异性强 灵敏度高样品可以是：毛发、血痕 单细胞、病原体、肿瘤残留物、犯罪现场遗留物25基因诊断中常用的PCR技术：（1）、DNA PCR：（2）、RT-PCR：以DNA为模板，扩增特定核。