阅读量：

308

作者：

倪静

展开

摘要：

Taq DNA聚合酶作为生物技术中重要的工具酶,在PCR技术中发挥了至关重要的作用.耐高温Taq DNA聚合酶的出现突破了PCR技术中聚合酶高温失活的瓶颈,使PCR技术得到飞速发展,不仅加快了基因分型,分子克隆,定点诱变,DNA测序以及DNA多态性等生物学领域的研究,同时也广泛应用于癌症早期诊断与预防,病原体检测与鉴定,产前诊断以及司法鉴定等医学领域.随着生物技术的迅速发展,现有DNA聚合酶已经不能满足体外诊断方法的要求.为了满足现代体外诊断方法和分子克隆技术对Taq DNA聚合酶模板敏感度和扩增速率等性能的需求.本研究将CL7与Taq DNA聚合酶进行融合表达,以改善其酶学性质.CL7蛋白质是大肠杆菌来源的具有结合DNA能力的核酸酶结构域的突变体,研究发现重组CL7-Taq DNA聚合酶的热稳定性,扩增速率,模板敏感度以及对抑制剂的耐受性等酶学性质均有显著增强.此外,在小鼠的基因分型和癌症相关基因的检测等研究领域等实验,CL7-Taq DNA聚合酶展现了超高敏感度的优势,无需提取基因组DNA,能快速准确地检测出小鼠的基因型.血液样品耐受性的相关实验,发现其不仅能够扩增含有抑制剂的微量模板,对血液样品的耐受性也显著提高.因此,CL7-Taq DNA聚合酶在分子生物学领域以及疾病诊断与治疗,传染病检测等医学诊断领域中具有广阔的应用前景,同时为Taq DNA聚合酶的改造提供了一种新的思路.本实验的研究内容主要包括以下几个方面:1.CL7-Taq DNA聚合酶的表达与纯化将合成的CL7-Taq基因克隆到p ET-30a载体上,获得CL7-Taq蛋白质的表达质粒p ET30a-CL7-Taq,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,挑取单菌落进行摇瓶培养并诱导表达,然后用Ni-亲和层析纯化CL7-Taq DNA聚合酶.2.CL7-Taq DNA聚合酶的酶学性质研究获得了纯度较高的CL7-Taq DNA聚合酶后对其热稳定性,扩增速率,模板敏感度,以及对PCR抑制剂的耐受性等酶学性质进行了研究,并与野生型的Taq DNA聚合酶进行对比.实验结果表明,CL7-Taq DNA聚合酶的热稳定性和抑制剂的耐受性有显著增强,PCR扩增速率提升至4 kb/min,是野生型Taq DNA聚合酶的两倍,同时模板敏感度提高了约一百倍.3.CL7-Taq DNA聚合酶的应用为了探讨CL7-Taq DNA聚合酶在体外诊断领域的应用,本研究用血液作为模板通过ARMS-PCR来检测乳腺癌易感基因(BRCA1)的单核苷酸突变(SNPrs12516).由于CL7-Taq DNA聚合酶对血液样品的耐受性以及对模板的敏感度显著增强,可以直接进行以血液样品为模板进行PCR,从而省去了样品预处理的步骤,不仅降低了成本还极大的缩短了检测时间.此外,我们还将CL7-Taq DNA聚合酶用于基因分型研究,成功的通过微量的模板对小鼠的基因型进行检测.

展开