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DNA 甲基化

DNA 去甲基化：5mc,5hmc,5fc和5cac

亚硫酸氢盐测序

DNA 免疫沉淀 (DIP)

捕获 5hmC、5fC 和 5caC 的替代方法

DNA 修饰测序方法的比较

液相色谱串联质谱法 (LC/MS-MS)

DNA 修饰 IHC/ICC

甲基结合域蛋白 (MBDs)

新型 DNA 修饰

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DNA 化学修饰为 DNA 序列编码基因的表达增加了一层调控机制。这些化学修饰中，研究得最透彻的是 5-甲基胞嘧啶 (5mC)，该修饰被通常认为是基因表达的一种稳定的抑制性调控因子。人类基因组含有大约 1% 的甲基化胞嘧啶，因此其是最丰富、最广泛的 DNA 修饰 (Moore et al 2012)。有几种对整个基因组中 5mC 进行测序的方法，这些方法各有利弊，我们稍后将在本指南中进行讨论。这些方法包括全基因组亚硫酸氢盐测序、抗体依赖性 DNA 免疫沉淀 (DIP) 或 MeDIP 等高分辨率方法。

5mC 最初被发现位于 CpG 岛内，CpG 岛是富含CpG二核苷酸的基因启动子区域常见的一段DNA片段。在这些启动子区域内，5mC 充当了一种抑制基因转录的稳定的表观遗传标记的角色。在哺乳动物基因组内，甲基化胞嘧啶最初在早期发育过程中通过从头甲基转移酶 DNMT3a 和 DNMT3b 被整合到 DNA 中 (Okano et al 1999)。随后，一种额外的甲基转移酶 DNMT1 在 DNA 复制过程中复制 DNA 甲基化模式到子链，从而将这些甲基化标记维持在整个基因组中 (Vertino et al 1996)。

目前，将 5mC 视作一个完全稳定的 DNA 修饰这一想法尚不实际。整个基因组中的许多甲基化胞嘧啶，特别是基因体内的甲基化胞嘧啶，都会经历一个被称作 DNA 去甲基化的过程 - 这一过程最终会去除 5mC，将甲基化胞嘧啶转化为未修饰的胞嘧啶（C）。DNA 去甲基化能够通过以下两种方式中的任一种方式发生：DNA 被动去甲基化：由于缺少甲基化维持酶，甲基化的胞嘧啶在基因组中被稀释掉。或 DNA 主动去甲基化：5mC 被 10-11 易位 (TET) 酶氧化为 5mC 的氧化衍生物（参见 Wu et al 2017）。

DNA 主动去甲基化呈周期性，从 5mC 开始，以未修饰的 C 结束。5mC 首先被氧化为 5-羟基甲基胞嘧啶（5hmC），再进一步被氧化为 5-甲酰基胞嘧啶（5fC），后者最后再一次被氧化为 5-羧基胞嘧啶 (5caC)。接下来，胸腺嘧啶 DNA 糖基化酶 (TDG) 与碱基切除修复 (BER) 共同将 5fC 和 5caC 从 DNA 中去除，产生一个未修饰的 C（图 8）。5hmC、5fC 和 5caC 已是许多近期表观遗传学研究的焦点。关于这些表观遗传标记的发现越来越多，包括其可能具有稳定的表观遗传作用。人们已经开发了许多测序方法来区分整个基因组中的这些标记，包括利用 5hmC、5fC 和 5caC 抗体进行的 MeDIP看到的差异 ，以及利用亚硫酸氢盐测序看到的差异，如 TET 辅助亚硫酸氢盐测序 (TAB-seq)。这些方法之间的差异稍后将在本指南中进行讨论。

图 1. DNA 去甲基化循环。胸腺嘧啶 DNA 糖基化酶（TDG）与碱基切除修复（BER）或 5hmC、5fC 或 5caC 的复制依赖性稀释共同作用，引发 DNA 主动去甲基化。主动修饰 - 被动稀释（AM-PD）。主动修饰 - 主动去除（AM-AR）。

使用传统的 DNA 扩增方法检测 5mC 是不可能的，因为5mC标记在样本制备和DNA扩增过程中不能维持。亚硫酸氢盐转化是将 DNA 甲基化标记转化为适合扩增和下游分析的模板所使用的最广泛的方法之一。亚硫酸氢盐转化是利用 NaOH 和亚硫酸氢钠对 DNA 进行处理的化学反应，在该化学反应过程中，胞嘧啶碱基被转化为尿嘧啶 (U)，而甲基化的胞嘧啶则不会被转化（图9）。

在 PCR 或测序等下游分析过程中，在亚硫酸氢盐反应中发生脱氨基反应的非甲基化 C 碱基将被检出为胸腺嘧啶 (T)，而 5-mC 碱基将保持不变，仍被测序检出为 C。这样即可确定在基因组中含有甲基化胞嘧啶的位置 (Frommer et al.,1992)

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图 2. 亚硫酸氢盐转化。用亚硫酸氢盐（磺化）处理 DNA 使胞嘧啶残基发生脱氨基反应，并被转化为尿嘧啶，(A) 但5-甲基胞嘧啶残基保持不变 (B)

基于亚硫酸氢盐的应用

亚硫酸氢盐转化已经成为为高通量应用或更广泛的全基因组范围的研究而设计的几种变体和应用的基础。

下面是基于亚硫酸氢盐的方法的一些示例。

全基因组 DNA 甲基化分析

全基因组亚硫酸氢盐测序 (WGBS; Lister et al 2009)

简化代表性亚硫酸氢盐测序 (RRBS; Meissner et al., 2005)

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​​靶向 DNA 甲基化分析

甲基化特异性 PCR (MS-PCR; Herman et al., 1996)

焦磷酸测序 (Colella et al., 2003; Tost et al., 2007)

高分辨率熔解曲线 (HRM) 分析 (Wojdacz and Dobrovic, 2007)

甲基化敏感的单核苷酸引物延伸 (MS-SnuPE; Gonzalgo and Jones PA, 1997)

​​​亚硫酸氢盐转化：技术考量

​​不完全转化

亚硫酸氢盐转化是一种非常有效的方法，其操作相对简单，并可以提供 DNA 甲基化状态的单碱基分辨率。但是，这种方法确实存在一些缺点：在次优反应条件（导致 DNA 变性不足）下，或反应完成前 DNA 链重新退火时，可发生不完全转化（偶尔还会发生过度转化）。

区分 5hmC

DNA 降解通常是由剧烈的亚硫酸氢盐转化反应条件导致，因而少量样本的处理难度会增大。反应过程中，去磺化不充分会残留可抑制 PCR 中使用的 DNA 聚合酶活性的物质。最新证据表明，5mC 和 5hmC 亚硫酸氢盐转化不作区分，因此降低了 DNA 序列的总体复杂性。降低序列复杂性会增加 PCR 下游询问引物设计的复杂程度，或者增加将测序读段唯一地定位到参考基因组的难度。

另一种常用于绘制 DNA 甲基化标记位置的方法是 DIP。DIP 在很大程度上依赖于拥有能够识别目标 DNA 修饰的抗体。但是，如果您拥有这种抗体，DIP 将会是一种直接有效的方法。与需要进行全基因组测序的 WGBS 测序相比，这一技术价格更低，而且更易分析。DIP 只需要对免疫沉淀步骤中拉下的被剪切的小 DNA 区域进行测序。

DIP 已经成功应用于已表征最充分的 DNA 修饰：5mC、5hmC、5fC 和 5caC (Pastor et al., 2011, Shen et al., 2013)。而且还被用于一系列样本，包括胚胎干细胞 (ES)、脑组织和斑马鱼胚胎。该方法类似于 ChIP，但您的起始物料是不需要染色质的原始基因组 DNA。这种基因组 DNA 会被剪切到约 150-300 bp 大小，剪切后的 DNA 可以发生热变性。该步骤至关重要，因为抗体仅能够识别变性（开放）的DNA 内的修饰。

DNA 变性后，剪切的 DNA 与识别靶标修饰的抗体一起孵育，通常孵育过夜，然后样本通过 IP 步骤拉下与抗体结合的所有 DNA，并洗去任何未结合的 DNA。我们建议使用磁珠进行该 IP 步骤。当您进行 DIP 时，要点是用 RNase 处理您的初始基因组 DNA，从而去除样本中的任何 RNA。

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图 3. DIP 方法学。剪切基因组 DNA，使用靶向 DNA 修饰的抗体进行免疫沉淀。然后将拉下的 DNA 和input样本用于 qPCR、微阵列或 NGS。

基于 DIP 的应用

​​全基因组 DIP 分析

DIP-测序 (Pastor et al., 2011)

​​​靶标 DIP 分析：

DIP-PCR (Pastor et al., 2011)

DIP：技术考量

​​适当剪切您的样本。与 WGBS 不同，DIP 不是单碱基分辨率。剪切 DNA 样本时，要点是DNA 片段大小为 150-300 bp，以提高 DIP 测序的分辨率。大片段意味着您不可避免地会拉下在您的目标 DNA 修饰前后更多的 DNA 序列，抗体与这些 DNA 序列不会物理结合。这会导致您的测序分析中出现宽的非特异性峰。

寻找高效抗体。特异的靶标修饰抗体对 DIP 来说至关重要。确保抗体与类似的修饰（例如 5fC 和 5hmC）的交叉反应性最低。使用抗体进行此类测序的优势在于，您仅受是否有可用抗体的限制。如果您想研究之前未在 DNA 中表征过的修饰，例如 m6A（通常与 RNA 相关），只要您有特异的 m6A 抗体，就可以作此研究。

捕获 5hmC，5fc 和 5cac 的替代方法

​​传统亚硫酸氢盐测序最大的缺点是无法区分 5mC 的氧化衍生物，只能描绘 5mC 本身。幸运的是，亚硫酸氢盐测序的变体有很多，此外，还有一些全新的方法可以解决 5hmC、5fC 和 5caC 的测序问题。下面我们来详细地讨论其中的一些新方法。

5hmC 定位

Tet 辅助亚硫酸氢盐测序法 (TAB-seq; Yu et al., 2012)

氧化亚硫酸氢盐测序法 (oxBS-seq; Booth et al., 2012)

hMe-Seal. (Song et al., 2011)

用核酸外切酶进行选择性化学标记 (SCL-exo; Sérandour et al., 2016)

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​5fC/5caC 定位

M.SssI甲基化酶辅助亚硫酸氢盐测序法 (MAB-seq; Wu et al., 2014)

5fC 化学辅助亚硫酸氢盐测序法 (fCAB-seq; Song et al., 2013)

5caC 化学辅助亚硫酸氢盐测序法 (caCAB-seq; Lu et al., 2013)

化学标记促成的 C-T 转化测序法 (CLEVER-seq; Zhu et al., 2017)

​选择适合您需要的最佳 DNA 修饰检测方法很重要。如需量化修饰的绝对水平，您需要考虑是否需要单碱基分辨率，以及在您的模型系统或样本类型中使用该方法的可行性。下表汇总了一些可用的 5hmC、5fC 和 5caC 测序方法的重要特点。

仅适用于 5hmC 定位

名称

说明

单碱基分辨率？

可对修饰进行绝对定量？

参考文献

5hmC-DIP

用 5hmC 特异性抗体富集 5hmC。

否

否

Pastor, W. A. et al Nature 2011

TAB-seq

5hmC 转化为 5gmC，对其进行保护。5mC 通过 TET 酶转化为 5caC。亚硫酸氢盐转化后，5hmC 读取为 C。5mC 和 5caC 读取为 T。

是

是

Yu, M. et al Cell, 2012

oxBS-seq

使用 KRuO4 以化学方式将 5hmC 转化为 5fC，可在单碱基分辨率下区分 5mC 和 5hmC。

是

是

Booth, M. J. et al Science, 2012

hMe-Seal

5hmC 与叠氮-葡萄糖分子和生物素发生糖基化，利用生物素/链霉亲和素结合作用拉下富集 5hmC。

否

否

Song, C. X.

et al.Nature Biotechnology 2011

SCL-exo

5hmC 的叠氮-葡萄糖糖基化及后续生物素反应，而核酸内切酶活性在生物素-5gmC 处停止。

是

否

Sérandour, A. A. et al.Genome Biology 2016

​​5fC 和 5caC 定位

名称

说明

单碱基分辨率？

可对修饰进行绝对定量？

参考文献

5fC/5caC DIP

使用 5fC 和 5caC 特异性抗体富集这些标记。

否

否

Shen, L. et al.Cell 2013

MAB-seq

M.SssI 处理 DNA，将所有 C 转化为 5mC。然后，亚硫酸氢盐转化导致所有 C、5mC 和 5hmC 读取为 C。所有 5fC 和 5caC 读取为 T。

是

是

Wu, H., Nature Biotechnology 2014

fCAB-seq

EtONH2 保护基因组中的所有 5fC 在亚硫酸氢盐处理后不被氧化。

是

是

Song, X. et al.Cell 2013

caCAB-seq

EDC 用于催化5caC形成酰胺键，阻断 5caC 在亚硫酸氢盐转化时脱氨。

是

是

Lu, X. et al.JACS 2013

CLEVER-seq

丙二腈选择性标记 5fC，生成 5fC-M 加合物，在测序中被读取为 T。

是

是

Zhu, C.et al.Cell Stem Cell 2017

表 6：DNA 修饰测序法

​​如果您可以在实验室使用 LC-MS/MS，那么 LC-MS/MS 是对总基因组 DNA 中 DNA 修饰水平定量的最佳方法 (Le et al 2011 和 Fernandez et al., 2018)。使用绝对定量法，LC-MS/MS 可对任何物种和细胞类型的总 DNA 中已发现的所有 DNA 修饰进行平行定量 (Zhang et al 2012)。使用绝对定量法，您仅受采用何种作样本检测标准品用的同位素标准品的限制。

使用该技术并结合 DIP (DIP-MS)，您可以确定靶向 DNA 修饰的抗体是否与您的目标修饰进行了结合，而且可以查看其是否结合了任何其他非特异性修饰。如果您生成了 DIP input和拉下样本的 LC-MS/MS 数据，您应该可以看到，与input相比，您的目标修饰在拉下的样本中有所富集。您还可以使用这些相同的数据检测其他修饰，来看您的样本中是否有其他成分也富集了，以判读是否有非特异的抗体结合。目前正在开发的软件可以帮助您进行这种类型的分析。

LC/MS-MS：技术考量

技术挑战。MS 设备非常昂贵，而且专业性非常强。机器本身需要大量的维护，并且往往要求其自身的技术人员掌握一切运行情况。机器操作非常复杂，需要专门的培训，因此您自己可能很难获得这种类型的 MS 数据。如果您无法购买自己拥有的 LC/MS-MS 设备，可以考虑通过合作或有偿服务获得这些数据。

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​也可以做 IHC/ICC来检测 DNA 修饰。在标准 IHC/ICC 实验方案的基础上添加一些简单的步骤，即可完成对 DNA 修饰的检测。您需要考虑的最显著的差异是，如果修饰位于双链 DNA 内，那么靶向 DNA 修饰的抗体不能进入双链 DNA 内而不能结合该修饰。这意味着您需要使 DNA 变性，让其成为单链 DNA 而被抗体结合。

最常用的 DNA 变性方法是用酸处理您的样本。通常是将 4N 盐酸 (HCL) 直接加到 IHC/ICC 切片上 (Yamaguchi et al., 2013 和 Kaefer et al., 2016)。在加入一抗之前添加此步骤是最好的。使用洗涤剂（例如 PBS 0.1% Triton）对细胞或组织进行通透处理后，可清洗并加入 4N HCl 使 DNA 链变性。上述步骤完成后，要点是彻底洗掉酸，并用碱（例如，100 μM NaOH 的 PBS 溶液）对酸进行中和。洗掉并中和掉酸以后，您可以继续常规的 IHC/ICC 步骤并加入一抗。

在对 DNA 修饰进行 IHC/ICC 检测时，您还应该警惕您的抗体可能识别 RNA 上高度相似的其他修饰（例如 DNA 上的 5mC 和 RNA 上的 m5C）。为避免此问题，您可以通过 RNase 步骤处理您的样本，以去除存在的所有 RNA。同样，应优化此步骤，因为您的样本经 RNase 处理的时间过长也会对存在的 DNA 造成损伤。

DNA 修饰 IHC/ICC：技术考量

计算酸处理步骤所用的时间。

双重 IHC/ICC。

选择合适的 DNA 染色剂。

您可能会发现，由于酸处理步骤，您无法使用标准的 DNA 染色剂。例如，DAPI 可能不能很好地与酸处理后的 DNA结合，因为它识别的是双链 DNA 中的腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基。

碘化丙啶 (PI) 是多数实验室中常见的好的替代DNA染色剂。PI 可以识别双链和单链核苷酸链。

​这意味着它也会识别样本中的所有 RNA，因此请注意这一点。除此以外，您还可以找到许多可识别单链 DNA 的市售 DNA 染色剂。

​5mC 及其氧化衍生物在基因沉默和在 DNA 去甲基化后促进基因表达方面起着重要作用。现在已经知道，其中一些 DNA 修饰可以作为标记，将蛋白质招募到特定的 DNA 位点，改变基因表达，充当表观遗传标记。除 5mC 外，MBD3 和甲基 CpG 结合蛋白 2 (MECP2) 还能结合 5hmC。一旦与 5hmC 结合，它们就会在 DNA 可及性和转录激活中发挥作用 (Yildirim et al., 2011 和 Mellén et al., 2012)。

筛选DNA 修饰结合物的常用方法是先使用下拉技术，然后通过 MS 筛选任何被拉下的蛋白质。该方法已成功用于发现 5mC、5hmC 和 5fC 的结合物 (Iurlaro et al., 2013 和 Sprujit et al., 2013)。在此实验中，您需要创建一个包含目标修饰的合成的诱饵 DNA、包含其他修饰的诱饵以及未修饰的胞嘧啶，作为对照。这种诱饵 DNA的一端应与生物素分子相连，后者可用来将诱饵结合在连有链霉亲和素的磁珠上。然后将您目的样本中的蛋白提取物添加到被栓系的诱饵上，并通过各种洗涤步骤冲洗掉任何非特异性结合的蛋白。之后，您可以洗脱剩余的蛋白质并进行 MS 分析，来找出您的特定结合物。

MBDs：技术考量

​DNA 序列

修饰次数

洗涤

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​新型 DNA 修饰

​新型 DNA 修饰很可能存在，只是还没有被发现。现已证实，习惯上被视为 RNA 修饰的一些修饰也可能存在于 DNA 内。举个恰当的例子，N6-腺嘌呤甲基化，即 RNA 中的 m6A 和 DNA 中的 6 mA。这种修饰是最著名且最丰富的 RNA 修饰之一，但现在已经知晓它也存在于 DNA 内。发现这一现象的首批研究之一是 John Gurdon 的实验室在 2016 年进行的一项研究 (Koziol et al., 2016)。他们利用靶向 6mA 的抗体进行 DIP-seq 后发现，非洲爪蟾、小鼠和人类基因组中存在 6mA。

继该项研究之后，有多项研究表示斑马鱼和猪基因组 (Liu et al., 2016)、经受环境压力后的小鼠大脑 (Yao et al., 2017) 以及拟南芥基因组 (Liang et al., 2018) 内存在 6mA。2018 年的一项研究进一步发现了分别负责 6 mA 甲基化和去甲基化的酶，N6AMT1 和 ALKBH1 (Xiao et al., 2018)。存在主动添加和删除 DNA 修饰的酶表明，这些酶的存在确实有一定的目的，并且可能有自身的表观遗传学功能。

新型 DNA 修饰：技术考量

​​抗体可用性

参考文献

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