Hypo在英文中是低的词根，例如高血压和低血压的英文单词分别为hypertension和hypotension。因此hypomethylation理解为低甲基化。根据甲基化和低甲基化的英文定义可以这样理解：DNA甲基化主要与鸟嘌呤G相邻的胞嘧啶C的5号位碳原子发生甲基化修饰。而哺乳动物基因组中大部分CpG中的C是甲基化的，特别是在CpG岛区域中的胞嘧啶，大部分胞嘧啶是甲基化的，这是一种正常的现象。但是如果一段序列中CpG位点富集区的大部分C是没有发生甲基化的（本来应该是很多C发生甲基化）那么我们可以认为这段区域发生了低甲基化，也就是DNA hypomethylation。

在我们的上一期推送中介绍了卢煜明团队在近几年开发的基于PacBio平台的cfDNA甲基化检测技术，在该团队利用相关技术研究肝癌患者甲基化水平与健康人甲基化水平的差异时，他们发现PacBio-cfDNA甲基化水平相比于健康人低。在原文中作者写了与他们前期的发现吻合。我注意到这句话想追踪一下这个前期的发现是何时的发现，于是乎追踪到了这篇10年前的论文。今天推送的这篇10年前论文中，该团队还用的是传统的NGS-Bisulfite甲基化测序。作者首先分析了32名健康人的血浆DNA全基因组甲基化密度（Methylation Density），具体的分析策略是将将参考基因组分割为若干个长度为1Mb的Bin，每个Bin内的甲基化密度为发生甲基化的CpG二核苷酸的C的数量除以Bin内全部CpG二核苷酸的C的数量。下图展示了32个健康人的样本中每个Bins内每个人的甲基化密度水平。通过统计学分析，32个健康人每个Bins内甲基化密度的变异系数（CV）小于1.8%。因此，作者认为，可以利用健康人的全基因组甲基化密度的平均值作为甲基化密度参考值。

肝癌患者甲基化水平与健康人差异

紧接着，作者利用同期搜集的26名肝癌患者的血浆DNA样本进行了对比性研究。首先作者在论文中提到了这26名肝癌患者的BCLC分期，并且给出了这些病人的详细信息。这个BCLC分期有必要提前科普一下。

巴塞罗那分期（Barcelona Clinic Liver Cancer ）是一种肝癌临床分期系统，这种系统的引入将有助于评估病人的患病情况，提供准确治疗方案和预测患者预后。BCLC肝癌临床分期系统由Llovet在1999年提出，后经美国肝脏疾病研究协会在2005年进行修改。BCLC主要包含了四类预后因素（1）病人的一般状态（2）肿瘤的状态（3）肝功能状态（4）可供选择的治疗方法。巴塞罗那肝癌临床分期系统(BCLC)如下，图片来源于国际顶尖医学杂志新英格兰医学杂志2019年的发表的肝癌综述。BCLC分期系统被认为是最好的分期系统而且在大量的临床研究中得到证实。BCLC肝癌临床分期可以分成五期，

1.极早期，单个病灶≤2cm，治疗方案以消融和手术切除为主，预期生存期大于5年

2.早期，单个病灶＞2cm，或2-3个病灶，每个病灶都≤3cm，治疗方案介入消融，手术切除和肝移植，预期生存期大于5年

3.中期，3个以上的病灶不论大小，或者2个及以上的病灶任何一个大于3cm，治疗方案以介入化疗栓塞为主的综合治疗，预期生存期大于两年

4.晚期，不论肿瘤大小和数目，存在血管侵犯或远处转移，治疗方案以靶向免疫为主的综合治疗，预期生存期19个月到23个月

5.终末期，最佳支持治疗，预期生存期3个月左右

巴塞罗那分期（Barcelona Clinic Liver Cancer ）是一种肝癌临床分期系统，这种系统的引入将有助于评估病人的患病情况，提供准确治疗方案和预测患者预后。BCLC肝癌临床分期系统由Llovet在1999年提出，后经美国肝脏疾病研究协会在2005年进行修改。BCLC主要包含了四类预后因素（1）病人的一般状态（2）肿瘤的状态（3）肝功能状态（4）可供选择的治疗方法。巴塞罗那肝癌临床分期系统(BCLC)如下，图片来源于国际顶尖医学杂志新英格兰医学杂志2019年的发表的肝癌综述。BCLC分期系统被认为是最好的分期系统而且在大量的临床研究中得到证实。BCLC肝癌临床分期可以分成五期，

1.极早期，单个病灶≤2cm，治疗方案以消融和手术切除为主，预期生存期大于5年

2.早期，单个病灶＞2cm，或2-3个病灶，每个病灶都≤3cm，治疗方案介入消融，手术切除和肝移植，预期生存期大于5年

3.中期，3个以上的病灶不论大小，或者2个及以上的病灶任何一个大于3cm，治疗方案以介入化疗栓塞为主的综合治疗，预期生存期大于两年

4.晚期，不论肿瘤大小和数目，存在血管侵犯或远处转移，治疗方案以靶向免疫为主的综合治疗，预期生存期19个月到23个月

5.终末期，最佳支持治疗，预期生存期3个月左右

这26名肝癌患者中，25名处于早期（BCLC-A），1名处于中期（BCLC-B），22名携带乙肝病毒，1名携带丙肝病毒。通过NGS-Bisulfite测序并与健康人比较，作者发现这26名肝癌患者的大部分都有至少30以上的Bins内的甲基化密度（MD）低于健康人。并且，作者还用了相对严格的统计学指标，只有同一个Bin内的MD的平均值处于对应参考平均值-3倍标准差之下的Bin才能视为低甲基化水平的Bin。在这种统计学限定下，符合的Bins一定是甲基化水平极显著低的。如果读者不了解什么是均值±3倍标准差，文末关于正态分布的一张图解。

由于作者发现，大部分肝癌患者的甲基化水平低于健康人，是否可以使用一个cut-off值作为区分是否可能有肝癌的阈值。是否可以选择与参考Bins的平均甲基化百分比值相比的一个阈值，例如当有百分之X的Bins与参考Bins相比存在极显著低的甲基化密度，那么可以认为该样本存在肝癌风险。作者进一步通过ROC曲线确定了这个阈值：1.1%（上图所示）。在这个阈值下，符合要求的NGS-Bisulfite测序数据用于判断肝癌风险的灵敏度为81%，特异性为94%。在作者后续的研究中，经过系统地比较和分析，这种基于NGS-Bisulfite的低甲基化检测方法可以被认为是无创早检肝癌的一种可取方法，具有一定的应用潜力。

正态分布特征

在统计上，68–95–99.7原则是在正态分布中，距平均值小于一个标准差、二个标准差、三个标准差以内的百分比，更精确的数字是68.27%、95.45%及99.73%。即为3σ准则：

数值分布在（μ-σ,μ+σ)中的概率为0.6827；

数值分布在（μ-2σ,μ+2σ)中的概率为0.9545；

数值分布在（μ-3σ,μ+3σ)中的概率为0.9973；

可以认为，一个正态分布的数据集的取值几乎全部集中在（μ-3σ,μ+3σ)区间内，超出这个范围的可能性仅占不到0.3%。

参考

写在后面的

在这篇论文中，作者不仅提出了低甲基化检测策略用于肝癌的无创早期检测，同时他们还同时探索了能否在亚硫酸盐测序数据中准确识别肿瘤相关拷贝数畸变（Tomor-associated copy number aberrations, CNAs）。由于后者我还没有系统了解过，所以暂时没有在这篇推送中分享。

写在后面的

在这篇论文中，作者不仅提出了低甲基化检测策略用于肝癌的无创早期检测，同时他们还同时探索了能否在亚硫酸盐测序数据中准确识别肿瘤相关拷贝数畸变（Tomor-associated copy number aberrations, CNAs）。由于后者我还没有系统了解过，所以暂时没有在这篇推送中分享。

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