生物硫醇如谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）和硫化氢（H2S）在生物体内与多种生理病理过程相关。近年来，已经有多种方法对生物硫醇检测，包括荧光、质谱、高效液相色谱和毛细管电泳等。但是，在原位条件下或正常活细胞水平里同时区分并定量检测这些生物硫醇仍然具有较大的挑战性。19F-NMR作为一项能够提供化合物原子分辨水平的工具，因其无背景干扰，较高的检测灵敏度和天然丰度，在生物大分子结构的动态与互作以及小分子的检测研究中得到广泛的关注。

图1. 氟标签检测生物硫醇反应机制。图片来源：Anal. Chem.

近年来，南开大学苏循成教授（点击查看介绍）团队致力于细胞内原子分辨率水平上的蛋白质动态结构变化和重要生物小分子的活性定量分析。该团队通过蛋白质定点标记方法，发展了顺磁核磁共振测定活细胞内蛋白质三维结构方法（Chem. Commun., 2016, 52, 10237--10240），联合应用NMR和EPR的双电子自旋共振研究细胞内寡聚蛋白质稳定性（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2020, 117, 20566-20575），应用19F-NMR定量评价溶液中手性金属配合物物种转化速率并应用蛋白质定点修饰（Chem. Commun., 2021, 57, 4291-4294.）。最近该课题组报道了通过19F-标签同时定量测定复杂生物样品中氨基酸（Chem. Commun., 2021, 57, 13154-13157）。在此基础上，近期该团队利用活性氟标签（图1），通过不同硫醇与氟标签生成产物的化学位移具有明显的差异，从而实现了多种生物硫醇的同时定量检测，这种方法对于内源2 μM浓度左右的生物硫醇有较高的检测灵敏度。同时利用该技术对活细胞生物硫醇的含量进行了定量分析，该工作发现不同动物细胞系谷胱甘肽的稳定性存在显著的差异并解释了其水解机制。

在本研究中，研究人员通过一种反应性的氟标签与四种生物硫醇快速的反应生成稳定的硫酯，这类生物硫醇形成的硫酯具有特征的化学位移并在一维19F谱上具有明显的区别，特别是半胱氨酸、谷胱甘肽和高半胱氨酸的氨基可与氟标签反应生成特征的指纹峰（图2）。根据化学位移的差异，可以实现生物硫醇的同时区分并定量检测（图3）。

图2. a) 氟标签与生物硫醇反应产物分析，可以看出不同生物硫醇有不同的指纹序列；b) 生物硫醇混合物与19F标签反应产物氟谱，该类氟标签与生物硫醇形成的硫酯与酰胺具有明显不同的化学位移。图片来源：Anal. Chem.

图3. 不同样品中生物硫醇同时定量测定。图片来源：Anal. Chem.

研究表明，该19F标签可以成功同时进行多种生物硫醇的区分与定量检测，检测误差小，具有较高的准确性和重复性，在μM浓度级别的生物硫醇都具有较高的检测灵敏性。根据上述结果，研究人员进一步对活细胞内的生物硫醇进行了测定（图4）。

图4. 19F-NMR检测不同哺乳动物细胞系生物硫醇，并且不同细胞样品中GSH具有不同的稳定性。图片来源：Anal. Chem.

In-cell NMR实验结果表明，这类反应性的氟标签可以快速进入到细胞内并与内源的GSH反应生成稳定的硫酯，生成的硫酯化合物并能在细胞内外进出。通过NMR可以区分细胞内和细胞外的GSH。作者发现在所研究的癌细胞样品中GSH具有较大的不稳定性，并且逐渐水解成Cys。而正常细胞的GSH具有较大的稳定性，在实验过程中没有发现明显的水解情况。研究人员发现细胞内源的自由硫醇主要是GSH，而Cys的含量在GSH的10%以下，并且没有明显的H2S。通过不同实验方法，研究者定位了GSH水解只发生在细胞膜表面而不在细胞内部。

图5. GSH在不同细胞系的表观水解速率。图片来源：Anal. Chem.

本文进一步通过NMR研究了GSH在细胞表面的分解速率。结果表明不同细胞的GSH水解速率存在显著差异，其中所研究的几类癌细胞中GSH水解明显快于正常细胞内水解速率，对于所研究的正常HEK293T细胞，在四个小时内没有发现明显的水解现象而A549细胞表现出超快的水解速率（图5）。GSH转移酶（GGT）是比较普遍的γ-肽键水解酶，通过加入GGT抑制剂的结果发现，该类GGT抑制剂能较大程度降低癌细胞里GSH的水解。通过比较不同细胞系的GSH水解活性，研究者推测不同细胞类型GGT活性差异并不应简单归结为GGT表达量，GGT的翻译后修饰程度如糖基化等很可能是影响GGT活性的重要因素，这为下一步工作提供了重要思路。

总结

研究人员利用高活性氟标签实现了多种生物硫醇的同时定量检测和活细胞内硫醇的检测，并能在原子分辨层次上阐述GSH在不同细胞系中的稳定性和水解程度，进一步阐明了癌细胞膜表面GSH的水解速率。高分辨19F-NMR无痕检测并且能从原子分辨层次对这类重要生物硫醇定量检测和在原位情况下测定硫醇间的相互转化。19F-NMR为在生物体系中的小分子的检测拓宽了视野，提供了一种新的检测酶活性的方式，并能从原子分辨层次阐述重要活性小分子在细胞内转化过程。该工作得到了国家自然科学基金委重大项目研究资助（21991081）。

这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者为南开大学硕士研究生崔朝玉和博士研究生李斌。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Simultaneous Quantification of Biothiols and Deciphering Diverse GSH Stability in Different Live Cells by 19F-Tag

Chao-Yu Cui‡, Bin Li‡, Dan Cheng, Xia-Yan Li, Jia-Liang Chen, Ya-Ting Chen, and Xun-Cheng Su*

Anal. Chem., 2021, DOI: 10.1021/acs.analchem.1c03673

导师介绍

苏循成

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