【技术实现步骤摘要】 生物电催化系统促进P450催化甾体羟基化反应的方法本专利技术涉及一种生物电催化系统促进P450催化甾体羟基化反应的方法，属于生物基因工程领域。技术介绍甾体药物被广泛用于抗炎、抗癌、抗过敏以及避孕药等，是未来全球药物市场上最具有影响力的药物种类之一。甾体母核的羟基化反应是赋予甾体特殊生理药理活性的重要方式之一，在甾体工业上常见的反应有C7α,C9α,C11α,C11β,C16α,C17α羟基化等。然而这些羟基化反应的完成对于传统的化学合成工艺是巨大的挑战，因此由细胞色素P450单加氧酶介导的微生物转化是甾体工业上生产药物中间体的最重要手段之一。利用微生物转化法合成甾体化合物，专一性强，立体选择性较高，并且副产物少，弥补了化学合成法的不足之处；同时，微生物转化条件温和，步骤简单，避免了大量有机溶剂和化工原料的使用，因此微生物转化过程是一个环境友好型绿色过程。由于P450催化的甾体羟基化反应需要大量还原型辅酶提供电子，即为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及其磷酸化形式(NADPH)，因此还原辅酶或还原力的供给是甾体中间体生物合成的重要限制性因素。为了促进NAD(P)H的有效再生，大多研究主要基于两种策略，一是引入辅助的酶催化的辅酶再生系统，或改变与NAD(P)H相关的代谢路径，促使更多的电子流再生还原力。例如，Tsuyoshi等人将甘油脱氢酶(GLD)与P450cam在大肠杆菌中共表达，显著提高了产物5-exo-hydroxycampor的产量。除此之外，乙醇脱氢酶(ADH)、甲酸脱氢酶(FDH)、葡萄糖脱氢酶(GDH)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)也被相关文献报道，可被引入生物催化剂中进行NADH或NADPH的原位再生过程，以促进相应需要还原辅酶的反应进行。另外，Arnold和其工作者通过改造与NAD(P)H有关的代谢路径，使得宿主内部部分呼吸链失活，调整了体内辅酶的还原型与氧化型之间的比例，从而显著促进了P450PMOR2催化的单加氧反应。技术实现思路目前涉及相关P450酶系的催化工程，多采用基因工程改造后微生物的全细胞催化。然而对于需要大量电子供体的细胞色素P450单加氧酶来说，还原力供给不足仍是限制大多数甾体羟基化反应的实际应用的重要因素。为了进一步解决甾体羟化过程中还原力供给不足的问题，本专利技术向P450酶全细胞催化系统中引入体外电子传递途径(EET途径)驱动NAD(P)H再生，结合了电化学和P450酶全细胞催化系统，实现了碳源电子供体和电极电子供体对P450介导的单加氧反应的协同驱动作用，即为细胞色素P450酶生物电催化系统。本专利技术以CYP7B1(7α羟化酶)的全细胞转化系统为例，DHEA(I)、7α-OH-DHEA(II)分别为该羟化反应的底物和产物(如图2)，为P450介导的单加氧反应在甾体工业上的发展和改良提供了良好的借鉴。本专利技术所要解决的技术问题是提供一种生物电催化系统促进P450催化甾体羟基化反应的方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供的生物电催化系统促进P450酶单加氧反应的方法，包括下列步骤：(一)DNA合成及重组菌构建从NCBI数据库中获得(NP_031851.3)来自鼠源7α羟化酶的cDNA序列，由北京擎科生物公司密码子优化后合成并置于克隆载体pUC57，随后由cyp7b1-F/R引物PCR扩增得到cyp7b1基因；利用PTEF1-F/R和TCYC1-F/R引物扩增SaccharomycescerevisiaeBy4742染色体基因组上的启动子PTEF1和终止子TCYC1，并通过基因拼接获的目的片段P-cyp7b1-T，并由通过限制性酶切位点HindIII/BamHI连接到表达载体pRS426上，获的目的重组质粒pRS426-cyp7b1。敲除酵母染色体基因atf2和ayr1基因。因为酵母染色体基因atf2和ayr1分别编码了作用于底物DHEA的3β-乙酰化酶和17β-羟化载体脱氢酶，生成副产物降低7α羟基化效率，因此先敲除atf2和ayr1基因。首先以S.cerevisiaeBy4742的染色体基因为模板，用atf2-Up-F/R及atf2-Down-F/R分别扩增得到atf2-UP和atf2-Down。然后以pRS415质粒为模板扩增获得LEU标签，利用OverlapPCR技术将三段基因拼接成atf2-UP+LEU+Down片段，并将此片段进行酵母转化实验，并于SC-L(亮氨酸营养缺陷型培养基)筛选培养基上获得基因敲除菌株S.cerevisiaeΔatf2，利用同样的方法进行基因ayr1敲除实验，使用组氨酸HIS筛选标签获得双基因敲除型菌株S.cerevisiaeΔatf2Δayr1，最后进行重组质粒pRS426-cyp7b1的转化实验并于SC-U(尿嘧啶营养缺陷型培养基)上选出目标重组菌株S.cerevisiaeΔatf2Δayr1/cyp7b1实现组成型强启动子PTEF1调控的cyp7b1基因的过表达。用于PCR的引物见下表：上述引物为专利技术人独立设计完成的，未见在其他期刊杂志等途径公开或报道。(二)生物电催化系统电池装置的预处理①碳布阴极的预处理：首先将碳布裁剪为所需的尺寸大小，为2.5cm×3cm，然后在1MHCl溶液中浸泡过夜，用双蒸水反复冲洗干净，最后在纯丙酮中浸泡过夜，取出烘干后，用适当长度的导线与预处理后的碳布连接并用胶水粘连固定住，晾干备用。②质子交换膜(PEM)的预处理：首先将质子交换膜裁剪为生物电催化电池所需的尺寸大小，然后在1MHCl溶液中浸泡过夜，用灭菌后的双蒸水反复冲洗干净，最后在无菌水中浸泡备用。③生物电催化电池的组装：先将橡胶圈放在电池的阳极室和阴极室之间，然后用相配套的铁夹旋紧。阴极室内放入磁力搅拌子，碳布电极的导线穿透阴极室盖子上的导线孔伸到瓶盖外面，瓶盖上的通气孔与无菌滤器相连，把组装好的生物电催化电池装置放入高压蒸汽灭菌锅内121℃的条件下灭菌20min。转移至烘箱中烘干，最后放入超净工作台内待用。④阳极液的配制(50mMK2HPO4和50mMKH2PO4缓冲液)：称取17.116gK2HPO4·3H2O和10.206gKH2PO4于适量蒸馏水中彻底溶解，继续加蒸馏水定容至1.5L，121℃的条件下灭菌20min后备用。⑤在超净工作台内，将灭菌并烘干后生物电催化电池阴阳极室之间的铁夹打开，用镊子夹取一张处理好的浸泡在无菌水内的质子交换膜放在阴极室和阳极室中间，用夹子将阴极室和阳极室夹紧固定好，用量筒准确量取135mL阳极液倒入阳极室中备用。(三)P450酶生物电催化系统的组装①细胞的培养及收集：从SC-U平板上挑取新活化的单菌落接入装有30mLSC-U液体培养基的250mL锥形瓶中，200r/min、30℃振荡培养24h；取1mL转接到装有200mLSC-U体液培养基的2L锥形瓶中，继续振荡培养至对数生长期(约24h)。取35mL的培养液，5000r/min离心2分钟，用50mM磷酸缓冲液冲洗细胞3遍去除残留培养基培养基，重悬于135mL阴极液中至)OD600≈1.5，倒入阴极室中备用。②提前30min～1h将铂电极和Ag/AgCl参比电极电极放在超净工作台内用75％酒精擦拭，并在紫外灯照射下灭菌30min左右。然后将本文档来自技高网...

【技术保护点】 1.生物电催化系统促进P450催化甾体羟基化反应的方法，其特征在于，包括下列步骤：（一） DNA合成及重组菌构建从NCBI数据库中获得（NP_031851.3）来自鼠源7α羟化酶的cDNA序列，合成并置于克隆载体pUC57，随后由cyp7b1‑F/R引物PCR扩增得到cyp7b1基因；利用PTEF1‑F/R和TCYC1‑F/R引物扩增Saccharomyces cerevisiae By4742染色体基因组上的启动子PTEF1和终止子TCYC1，并通过基因拼接获的目的片段P‑cyp7b1‑T，并由通过限制性酶切位点Hind III/BamH I连接到表达载体pRS426上，获的目的重组质粒pRS426‑cyp7b1；敲除酵母染色体基因atf2和ayr1，具体步骤为：首先以S. cerevisiae By4742的染色体基因为模板，用atf2‑Up‑F/R及atf2‑Down‑F/R分别扩增得到atf2‑UP和atf2‑Down；然后以pRS415质粒为模板扩增获得LEU标签，利用Overlap PCR技术将三段基因拼接成atf2‑UP+LEU+Down片段，并将此片段进行酵母转化实验，并于SC‑L（亮氨酸营养缺陷型培养基）筛选培养基上获得基因敲除菌株S. cerevisiae Δatf2，利用同样的方法进行基因ayr1敲除实验，使用组氨酸HIS筛选标签获得双基因敲除型菌株S. cerevisiae Δatf2Δayr1，最后进行重组质粒pRS426‑cyp7b1的转化实验并于SC‑U（尿嘧啶营养缺陷型培养基）上选出目标重组菌株S. cerevisiae Δatf2Δayr1/cyp7b1实现组成型强启动子PTEF1调控的cyp7b1基因的过表达；（二） 生物电催化系统电池装置的预处理①碳布阴极的预处理：首先将碳布裁剪为所需的尺寸大小，为2.5 cm × 3 cm，然后在1 M HCl溶液中浸泡过夜，用双蒸水反复冲洗干净，最后在纯丙酮中浸泡过夜， 取出烘干后，用适当长度的导线与预处理后的碳布连接并用胶水粘连固定住，晾干备用；② 质子交换膜（PEM）的预处理：首先将质子交换膜裁剪为生物电催化电池所需的尺寸大小，然后在1 M HCl 溶液中浸泡过夜，用灭菌后的双蒸水反复冲洗干净，最后在无菌水中浸泡备用；③ 生物电催化电池的组装：先将橡胶圈放在电池的阳极室和阴极室之间，然后用相配套的铁夹旋紧；阴极室内放入磁力搅拌子，碳布电极的导线穿透阴极室盖子上的导线孔伸到瓶盖外面，瓶盖上的通气孔与无菌滤器相连，把组装好的生物电催化电池装置放入高压蒸汽灭菌锅内121 ℃的条件下灭菌20 min；转移至烘箱中烘干，最后放入超净工作台内待用；④阳极液的配制（50 mM K2HPO4和50 mM KH2PO4缓冲液）： 称取17.116 g K2HPO4•3H2O 和10.206 g KH2PO4于适量蒸馏水中彻底溶解，继续加蒸馏水定容至1.5 L，121℃的条件下灭菌20 min后备用；⑤在超净工作台内，将灭菌并烘干后生物电催化电池阴阳极室之间的铁夹打开，用镊子夹取一张处理好的浸泡在无菌水内的质子交换膜放在阴极室和阳极室中间， 用夹子将阴极室和阳极室夹紧固定好，用量筒准确量取135 mL阳极液倒入阳极室中备用；（三） P450酶生物电催化系统的组装①细胞的培养及收集：从SC‑U平板上挑取新活化的单菌落接入装有30 mL SC‑U液体培养基的250 mL锥形瓶中，200 r/min、30℃振荡培养24 h；取1 mL转接到装有200 mL SC‑U体液培养基的2 L锥形瓶中，继续振荡培养至OD ≈ 6（24 h）；取约35mL左右的培养液，5000 r/min离心2分钟，用50 mM磷酸缓冲液冲洗细胞3遍去除残留培养基培养基，重悬于135 mL阴极液中至）OD600 ≈ 1.5，倒入阴极室中备用；②提前30 min ~ 1 h将铂电极和Ag/AgCl参比电极电极放在超净工作台内用75%酒精擦拭，并在紫外灯照射下灭菌30 min左右；然后将阳极铂电极的穿透阳极室盖子上的直径6 mm的孔伸到瓶盖外面，Ag/AgCl参比电极穿过阴极室盖子上的直径6 mm的孔伸到阴极室内，拧好阴极室的瓶盖；③将各个装好的生物电催化电池从超净工作台拿出，放在磁力搅拌器上，设置温度为30 ℃，转速为150 r/min左右；将阴极瓶盖上的通气孔加上气体过滤装置并与装有空气的钢气瓶的管子相连接；④打开电化学工作站和电脑，将生物电催化电池与电化学工作站相连，绿色线接工作电极（阴极室碳布电极）的导线，红色线接对电极（阳极室铂电极）的导线，白线接参比电极（阴极室 Ag/AgCl 电极）的导线；设置电化学工作站恒电位电压 ‑0.6 V vs. Ag/AgCl、运行时间等参数；（四）样品的提取、处...

【技术特征摘要】 1.生物电催化系统促进P450催化甾体羟基化反应的方法，其特征在于，包括下列步骤：（一）DNA合成及重组菌构建从NCBI数据库中获得（NP_031851.3）来自鼠源7α羟化酶的cDNA序列，合成并置于克隆载体pUC57，随后由cyp7b1-F/R引物PCR扩增得到cyp7b1基因；利用PTEF1-F/R和TCYC1-F/R引物扩增SaccharomycescerevisiaeBy4742染色体基因组上的启动子PTEF1和终止子TCYC1，并通过基因拼接获的目的片段P-cyp7b1-T，并由通过限制性酶切位点HindIII/BamHI连接到表达载体pRS426上，获的目的重组质粒pRS426-cyp7b1；敲除酵母染色体基因atf2和ayr1，具体步骤为：首先以S.cerevisiaeBy4742的染色体基因为模板，用atf2-Up-F/R及atf2-Down-F/R分别扩增得到atf2-UP和atf2-Down；然后以pRS415质粒为模板扩增获得LEU标签，利用OverlapPCR技术将三段基因拼接成atf2-UP+LEU+Down片段，并将此片段进行酵母转化实验，并于SC-L（亮氨酸营养缺陷型培养基）筛选培养基上获得基因敲除菌株S.cerevisiaeΔatf2，利用同样的方法进行基因ayr1敲除实验，使用组氨酸HIS筛选标签获得双基因敲除型菌株S.cerevisiaeΔatf2Δayr1，最后进行重组质粒pRS426-cyp7b1的转化实验并于SC-U（尿嘧啶营养缺陷型培养基）上选出目标重组菌株S.cerevisiaeΔatf2Δayr1/cyp7b1实现组成型强启动子PTEF1调控的cyp7b1基因的过表达；（二）生物电催化系统电池装置的预处理①碳布阴极的预处理：首先将碳布裁剪为所需的尺寸大小，为2.5cm×3cm，然后在1MHCl溶液中浸泡过夜，用双蒸水反复冲洗干净，最后在纯丙酮中浸泡过夜，取出烘干后，用适当长度的导线与预处理后的碳布连接并用胶水粘连固定住，晾干备用；②质子交换膜（PEM）的预处理：首先将质子交换膜裁剪为生物电催化电池所需的尺寸大小，然后在1MHCl溶液中浸泡过夜，用灭菌后的双蒸水反复冲洗干净，最后在无菌水中浸泡备用；③生物电催化电池的组装：先将橡胶圈放在电池的阳极室和阴极室之间，然后用相配套的铁夹旋紧；阴极室内放入磁力搅拌子，碳布电极的导线穿透阴极室盖子上的导线孔伸到瓶盖外面，瓶盖上的通气孔与无菌滤器相连，把组装好的生物电催化电池装置放入高压蒸汽灭菌锅内121℃的条件下灭菌20min；转移至烘箱中烘干，最后放入超净工作台内待用；④阳极液的配制（50mMK2HPO4和50mMKH2PO4缓冲液）：称取17.116gK2HPO4•3H2O和10.206gKH2PO4于适量蒸馏水中彻底溶解，继续加蒸馏水定容至1.5L，121℃的条件下灭菌20min后备用；⑤在超净工作台内，将灭菌并烘干后生物电催化电池阴阳极室之间的铁夹打开，用镊子夹取一张处理好的浸泡在无菌水内的质子交换膜放在阴极室和阳极室中间，用夹子将阴极室和阳...

【专利技术属性】 技术研发人员：宋浩，张紫音， 申请(专利权)人：天津大学青岛海洋技术研究院， 类型：发明 国别省市：山东,37