源自：中国抗癌协会

# SUMMARY #

2020年是极不平凡的一年。面对突如其来的新冠肺炎疫情，中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会发出“凝神聚力抗疫情，立足本职做贡献”的倡议，艰难方显勇毅，磨砺始得玉成，疫情并未影响广大肿瘤标志物领域科技工作者及临床专家们孜孜不倦的探索，2020年新型肿瘤标志物发现与鉴定领域均取得了丰硕成果，积极推动着临床转化的步伐，更为可喜的是国内不断涌现出影响世界的重要成果。

本文就2020年度肿瘤标志物领域研究进展做一概览。

#  2020年度学科研究进展  #

1

肿瘤突变负荷（TMB）标志物

肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）一般指特定基因组区域内每兆碱基对（Mb）体细胞非同义突变的个数，可以间接反映肿瘤产生新抗原的能力和程度[1]。自2014年发现这一标志物以来，众多的临床研究中都显示出TMB与免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）疗效的相关性，验证了组织TMB可作为免疫治疗独立的疗效预测生物标志物。但在临床研究和实践过程中TMB评估尚缺乏统一标准，并且缺乏中国患者人群临床研究数据，影响了其在免疫治疗中的广泛应用。

2020年6月16日，FDA加速批准了PD-1抑制剂帕博利珠单抗（KEYTRUDA，K药）用于治疗肿瘤突变负荷高（tTMB-H，组织TMB≥10个突变/Mb）、既往治疗后疾病进展且没有令人满意替代治疗方案的无法手术或转移性的成人和儿童实体瘤患者。这标志着TMB正式成为继MSI/dMMR后的第二个泛实体瘤免疫治疗伴随诊断生物标志物，用于帮助确定最有可能从帕博利珠单抗中受益的患者[2]。此次TMB获FDA批准是基于KEYNOTE-158 临床试验的阶段性结果[3] 。KEYNOTE-158是一项多中心、多队列、非随机、开放标签的试验，用于评估泛实体瘤患者中TMB-H与K药（每三周静脉注射200mg，直到疾病进展或出现不可接受毒性） 之间的关系。TMB 检测使用 的是Foundation One CDx（F1CDx），检测肿瘤患者的FFPET样本，TMB-H的阈值为≥10个突变/Mb。

2020年11月11日《肿瘤突变负荷检测及临床应用中国专家共识（2020年版）》（以下简称《TMB共识》）正式发布，《TMB共识》由中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会分子病理协作组和中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会遗传性肿瘤标志物协作组联合编撰发布。《TMB共识》从TMB的定义、临床意义、检测的标准化、TMB联合应用展望四个方面展开，对TMB检测的临床意义、检测过程中样本类型、检测方法、包含基因、生物信息学分析方法以及参考值设定等20个问题进行讨论剖析，综合国内外TMB检测和临床应用共识推荐、重要文献及临床实践，提出8个专家共识指导性意见。《TMB共识》在关于TMB分子病理检测技术流程方面，推荐使用近期石蜡包埋肿瘤组织样本进行组织TMB检测，待检测组织应首先完成病理质控并确保恶性肿瘤细胞数能够满足检测要求。若采用靶向测序Panel进行TMB评估时，建议与WES评估的TMB进行一致性评价，并提出了中国TMB检测亟待标准化的临床需求。同时《TMB共识》也指出了目前中国人群TMB的独立预测价值仍需更多临床研究数据的验证，以及由于TMB值在不同癌种中存在显著差异，建议临床检测时依据免疫检查点抑制剂（ICIs）临床疗效确定阈值等对在中国开展更多关于TMB临床研究的期望。

2

同源重组修复缺陷（HRD）标志物

同源重组修复缺陷（ homologous recombination deficiency, HRD）作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂重要的疗效预测标志物在患者管理中发挥越来越重要的作用，但在临床实践中，HRD的检测方法、评价体系与临床解读等标准化程度尚存不足，因此极大限制了其应用[4]。2020年鲁卡帕利及其伴随诊断F1CDx检测HRD获FDA批准。ARIEL3是一项随机、双盲、安慰剂对照的Ⅲ期研究，主要纳入铂敏感既往未接受PARP抑制剂治疗的复发高级别浆液性或子宫内膜样卵巢癌，评估鲁卡帕利维持治疗的临床疗效[5]。研究中应用F1CDx检测LOH确定HRD状态分层，LOH高cutoff值为≥16%，HRD阳性定义为BRCA突变型或BRCA野生型但LOH高。探索性分析结果显示，鲁卡帕利维持治疗组LOH高患者较LOH低患者的中位PFS从6.7月延长到9.7个月，而安慰剂组中，LOH高与LOH低组患者的中位PFS均为5.4个月，无统计学差异。基于上述研究结果，鲁卡帕利获FDA批准用于复发性上皮性卵巢癌、输卵管癌获原发性腹膜癌患者的维持治疗，Foundation FocusCDx BRCA LOH （ 已整合入F1CDx）也被FDA批准用于鲁卡帕利维持治疗复发高级别浆液性或子宫内膜样卵巢癌患者的补充诊断，以期筛选出更多可能获益的HRD阳性患者。PRO found是全球首个分子分型指导前列腺癌靶向治疗得到阳性结果的前瞻性Ⅲ期临床研究，其结果显示奥拉帕利可降低携带BRCA、ATM致病性或可能致病性突变的转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）患者66%的疾病进展或死亡风险，经独立评审委员会评估携带BRCA、ATM以及BARD1、 BRIP1、CDK12、 CHEK1/2、FANCL、PALB2、RAD51B/C/D以及RAD54L等其他HRR基因致病性或可能致病性突变的患者均可获得PFS改善[6]。基于该研究，FDA于2020年5月批准奥拉帕利用于经恩杂鲁胺或醋酸阿比特龙治疗进展后，HRR基因存在致病性或可能致病性突变的mCRPC成人患者；同时批准F1CDx作为其伴随诊断，以筛选更多可能获益的携带HRR基因变异的mCRPC患者。

2021年9月10日《同源重组修复缺陷临床检测与应用专家共识（2021版）》（以下简称《HRD共识》）由中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会遗传性肿瘤标志物协作组与中华医学会病理学分会分子病理学组联合编撰发布。《HRD共识》围绕HRD定义描述、HRD肿瘤临床病理与分子特征、HRD检测的临床应用价值、HRD检测样本选择、HRD检测技术选择与确认、HRD算法标准化及HRD临床检测和应用的问题等关键点，结合国内外应用现状，为临床提供7条HRD临床检测与应用专家共识。希望本专家共识可以提高临床医师及检测等相关人员对HRD临床意义及检测规范的认识，从而更加准确合理地开展HRD检测及结果解读，为患者提供更优质的临床服务。《HRD共识》中着重指出：HRD会产生特定的、可量化的、稳定的基因组改变，目前主要通过杂合性缺失（LOH）、端粒等位基因平衡（TAI）和大片段迁移（LST）3个指标的综合检测得出基因组不稳定评分（GIS），临床实践中以BRCA1/2基因致病性突变与GIS评估肿瘤HRD状态。其评估通常不受肿瘤取材部位（同一部位不同病灶或原发和转移病灶）影响。HRD检测优先选择3年以内的石蜡包埋肿瘤组织，并需保证有足够的肿瘤细胞用于检测，新鲜组织不推荐作为常规检测样本类型。建议提供患者配对外周血作为非肿瘤对照样本。在HRD临床检测中，基于SNP位点信息进行HRD评分计算的准确度主要依赖于对SCNV的准确分析；同时，通过WGS、WES等检测技术获取更多的基因组信息，有助于进一步提升 HRD评分计算的准确度；应用人工智能技术辅助分析HRD的多维度特征，已展示出高效识别HRD阳性人群的潜在优势。HRD评分阈值判定与不同癌种、不同PARP抑制剂及其相应适应证有关。

3

肿瘤蛋白标志物

为了解决基于基因突变筛选靶向药物无法对相关基因组特征的患者进行治疗的问题，中国科学院曾嵘研究组及其合作者绘制首个中国人结直肠癌及转移相关的多组学整合图谱，并直接针对蛋白质结果筛选了三种靶向药物[7]。建立靶向基因突变的药物的困难导致大量肺腺癌患者还没有适合的治疗方式。中国科学院谭敏佳团队及其合作者首次从蛋白质水平系统描绘了肺腺癌的分子图谱，发现了中国人群肺腺癌人群的蛋白质分子特征。确认HSP90β可作为肺腺癌的预后标记物[8]。找出肺腺癌发展过程中的非吸烟风险因素非常关键。来自台湾大学附属医院陈玉如研究组首次展现了东亚人群中非吸烟肺腺癌患者的蛋白质基因组学景观，揭开早期肺腺癌中独特驱动因素和性别相关差异，发现了MMP11作为早期检测和治疗的生物标志物[9]。复旦大学雷群英课题组在细胞水平、小鼠模型和临床样品水平首次揭示了BCAA-BCAT2代谢轴在PDAC早期发生中的重要作用，阐述了靶向抑制BCAT2或饮食中BCAA能减缓PDAC的进展[10]。PCSK9抗体抑制剂能降低血液中低密度胆固醇水平，然其肿瘤生物学功能知之甚少。杜克大学李川源课题组联合国内多家单位学者通过一系列肿瘤动物模型，证明抑制PCSK9活性，能增强肿瘤免疫治疗效果，肿瘤细胞内的PCSK9蛋白是肿瘤免疫治疗的新靶点[11]。

4

肿瘤代谢标志物

2020年肿瘤代谢标志物取得了一系列研究进展，其中甲基丙二酸被鉴定为哺乳动物衰老的重要标志物，随着年龄增长，血清中甲基丙二酸浓度逐步升高。进一步研究发现甲基丙二酸的累积可以促进癌细胞的侵袭和转移[12]。国内相关课题组也有若干重要研究成果：海军军医大学王红阳院士团队发现有抗衰老效应的标志物NAD+参与调节肿瘤免疫并改善免疫治疗，从而提出了通过补充NAD+前体增强免疫治疗耐受肿瘤对抗PD-1/PD-L1抗体治疗敏感性的新策略[13]。香港中文大学于君教授及其合作者研究团队通过对2个队列人群中肝癌患者和健康对照的门静脉血液代谢物变化进行综合代谢组学分析，并与肝组织和粪便样本中的代谢物变化进行比较。结果显示，肝癌患者的门静脉代谢物有特异性改变[14]。于君教授团队还发现高脂饮食能通过诱导小鼠肠道菌群失调、代谢改变和肠上皮屏障功能障碍，驱动结直肠肿瘤发生，并揭示了其中有潜在关键作用的细菌和代谢物[15]。张奇伟和张新荣团队合作开创分析单细胞空间代谢组新方法，可以实现单个细胞在组织网络中获取代谢指纹图谱，为肿瘤微环境的代谢标志物开辟了新方向[16]。

5

循环肿瘤DNA （ circulating tumor DNA,ctDNA）标志物

2020年以二代测序（next-generation sequencing,NGS）技术为标杆的ctDNA检测项目成功落地，使得ctDNA成为了肿瘤临床检测的重要手段。测序方法的应用大大提高了检测通量，并能发现更多潜在的肿瘤变异。通过对卵巢癌患者进行外周血NGS检测，能够同时发现BRCA1和BRCA2基因全编码区、外显子-内含子连接区、非翻译区和启动子区中的各种突变，全面指导聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase, PARP）抑制剂奥拉帕利的临床用药，延长BRCA突变阳性患者的无进展生存期[17]。此外，基于传统的荧光定量PCR方法，目前已在临床上获得批准应用的ctDNA项目有：PIK3CA突变检测与EGFR突变检测等。前者用于检测血浆11种PIK3CA基因突变，指导乳腺癌敏感突变患者药物治疗，后者用于检测血浆19外显子缺失和21外显子L858R敏感突变、20外显子T790M敏感突变，指导非小细胞肺癌患者对厄洛替尼、奥希替尼等EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI）的使用[18]。近年来，ctDNA的甲基化水平也可作为标志物用于肿瘤的诊断。例如，目前已广泛应用于临床的血浆SEPT9基因甲基化检测，可作为结直肠癌的筛选试验[19]。肺泡灌洗液中的SHOX2、RASSF1A基因甲基化检测也可用于早期肺癌的辅助诊断等。

6

循环肿瘤细胞（ circulating tumor cells,CTC）标志物

CLDN18.2作为一个崭新抗癌分子靶点引起业界广泛关注，在2020年AACR会议上，来自北京大学肿瘤医院的沈琳、张小田和国家纳米科学中心胡志远课题组合作的相关研究成果发表[20]，第一次证明了在胃肠道肿瘤患者中，使用肿瘤捕手（TumorFisher）纳米磁珠结合分子信标技术发现CLDN18.2 RNA在外周血CTCs中的表达与组织上CLDN18.2蛋白表达水平相关，CTC CLDN18.2的RNA检测有望成为预测CLDN18.2抑制剂在胃肠道肿瘤疗效的有效手段。在2020年NMPA批准了CTCs的Cell Search试剂盒作为三类诊断试剂，利用抗EpCAM抗体包裹的铁磁流体纳米颗粒阳性富集表达EpCAM的CTC细胞。2020年12月11日，圣安东尼奥乳腺癌研讨会（SABCS）线上举办，会议期间公布了一项全球性“关于循环肿瘤细胞（CTC）计数预测转移性乳腺癌（MBC）预后和疗效的14个临床试验的合并分析”结果。这是迄今为止最大的有关连续CTC计数在MBC早期治疗监测的合并分析。这项研究的重点是包括不同乳腺癌亚型。这是一项国际合作的汇总分析，包括在亚洲，欧洲和北美进行的多机构临床试验。研究人员从经过同行评审文献中发表的前瞻性临床研究获得身份不明的个体患者水平数据，以生成4,079名参与者的数据集，从而进一步定义和验证CTC计数在早期监测转移性乳腺癌患者状态中的作用，而不考虑HR和HER2亚型状态。

7

肿瘤外泌体标志物

2020年外泌体在肿瘤基础研究进行更深入拓展，主要内容有：独立于ESCRT的外泌体产生和分泌新途径[21]，可视化外泌体动力学特征研究[22]，外泌体负载分子介导肿瘤细胞与免疫细胞交互作用，参与肿瘤进展，免疫逃逸，治疗抵抗。外泌体检测技术基于外泌体质膜内或质膜上靶向分子交联电化学生物传感器或者荧光适体传感器进行质谱分析，用于肿瘤快速诊断。结合质膜上特定蛋白进行单个细胞外囊泡分析，用于肿瘤分类诊断[23]。外泌体示踪技术用于实时监测肿瘤进展和转移，细胞外囊泡特制芯片用于肿瘤筛查和癌症相关的细胞外囊泡定量分析[24]。工程化化外泌体提高药物和治疗性分子负载率，靶向递送用于肿瘤治疗。临床应用方面主要是外泌体或细胞外囊泡作为肿瘤诊断和治疗疗效评估，肿瘤进展监测分子标志物。对循环外泌体进行蛋白质谱分析用于肿瘤早期诊断[25]。在其他治疗方面也进行了相关探索，如仿生纳米海绵定向吸引肿瘤源性外泌体，减弱其促肿瘤作用[26]。工程化治疗性细胞外囊泡用于抗癌纳米药物的开发[27]。外泌体负载药物用于肿瘤治疗在动物模型中被证明有效。目前，外泌体研究在临床转化研究处于探索阶段。

8

肿瘤单细胞标志物

在各种致癌因素下，局部组织细胞因遗传物质受损而异常增生，并产生许多基因突变和致病性表型，形成不同的谱系，导致肿瘤及其微环境的异质性。单细胞测序可通过获得肿瘤内单个细胞的基因型及表型信息以构建与肿瘤发生、发展、转移、耐药性产生相关的遗传图谱，鉴定与肿瘤诊疗预后有关的生物标志物及治疗靶标。厦门大学杨朝勇教授团队发展了基于微流控技术的高通量单细胞测序新器件，一次测序即可获得成百上千个单细胞的转录组信息，为肿瘤异质性研究提供高效的分析工具[28]；该团队还开发了纳升级单细胞全基因组测序操控平台，为获得高均一性、高覆盖率、高准确性的稀有肿瘤细胞基因组文库提供重要工具[29]。北京大学汤富酬教授团队利用单细胞多组学分析技术，发现在结直肠癌患者肿瘤微环境中的某些基质细胞具有普遍的基因组变异，其中一些变异可作为预后不良的标志[30]。北京大学张泽民教授团队等在单细胞水平对结直肠癌患者的浸润髓系细胞类群进行了解析，并对靶向髓系细胞的免疫治疗策略进行了机制研究[31]。复旦大学中山医院樊嘉院士团队分析了18例原发性或早期复发肝癌患者~17000个细胞的转录本，发现了复发肿瘤细胞中潜在的免疫逃逸机制，为肝细胞癌生态系统提供了全面解析[32]。

9

肿瘤尿液标志物

2019年报道过种植10个左右肿瘤细胞的动物模型，在动物并不产生肿瘤的情况下，可以见到肿瘤细胞种植前后动物尿蛋白质组的变化。而且这个变化能够经受得住随机分组方法的检验。这个随机分组的方法，应该在比较两组之间的差别随机产生的可能性时未来应该有更多的应用。2020年报道的后续研究显示，如果控制种植肿瘤细胞的数量，使得近一半的动物有肿瘤发生，一部分动物没有肿瘤发生时，研究发现两组动物的尿蛋白质组有明显的不同[33]。这给我们的启示是如果我们未来真的有机会利用尿蛋白质组成功做到肿瘤的早期筛查，也许我们可以利用尿蛋白质组继续观察免疫系统和肿瘤的战斗，直到我们看到肿瘤有占上风的线索时再采取干预措施。在动物模型的研究上，2020年又分别报道了肝脏[34]和骨[35]的种植瘤所引起的尿蛋白质组改变。这为未来在临床样本上发现和验证肝脏转移瘤，骨转移瘤奠定基础。在临床样本的研究上报道了同一病人脑胶质瘤手术前后的尿蛋白质组比较研究方法。这个研究有效地减少了病人之间比较所产生的干扰因素，使得观察到的尿蛋白质组变化只和这个特定病人的肿瘤更具有直接相关性[36]。

10

肿瘤线粒体标志物

线粒体DNA（mtDNA）作为细胞中重要核酸物质，拷贝数高、突变率高、易于检测的特点使其作为新型生物标志物具有独特优势。Yuan Y 等发表在Nature genetics的泛癌研究对人类癌症中mtDNA特点进行了全面解析，并发现超过一半的肿瘤患者存在mtDNA异质性突变，且截断突变富集于肾癌、直肠癌和甲状腺癌患者[37] 。Alexander N. G. 等发表在Nature metabolism的研究报道，mtDNA截断突变的存在能显著降低肠癌患者死亡风险[38]。国内空军军医大学邢金良教授团队研究发现：肝癌组织中mtDNA调控区突变影响肝癌侵袭、转移，且与患者预后密切相关[39]；肝癌患者血浆中存在大量肿瘤来源mtDNA异质性突变[40]；血浆外泌体mtDNA在健康人对照，肝炎和肝癌患者中表现出不同的特征[41]。以上研究均提示，mtDNA有望成为新型肿瘤标志物。近年来，多组学检测结合人工智能技术用于肿瘤诊断模型建立成为趋势[42, 43]。基于血浆游离mtDNA多组学及机器学习技术构建肿瘤早诊及预后预测模型，有望助力肿瘤临床诊断和治疗。

#  未来发展方向  #

1

肿瘤突变负荷（TMB）标志物

TMB与其他免疫治疗分子标志物联合应用。作为一个新兴的ICIs治疗疗效预测标志物，TMB在临床应用中还处于一个初始阶段，其检测技术还在不断完善，临床意义也在不断丰富。最近有研究发现，TMB与其它肿瘤免疫治疗相关标志物（如PD-L1、MSI）联合应用，或许能提高免疫治疗疗效预测的准确性和精确性[44]，但具体联合策略还需要进一步临床探索。另外随着液体活检技术的发展，组织标本获取困难的患者通过评估血液TMB（bTMB）预测免疫治疗疗效和动态监测治疗变化成为可能。目前研究证据显示在NSCLC中bTMB与tTMB具有显著相关性，并且bTMB与NSCLC患者接受单药ICIs治疗获益显著相关[45]，但尚未获得高级别前瞻性临床研究证实，bTMB检测目前也无统一检测标准。

2

同源重组修复缺陷（HRD）标志物

HRD检测临床应用需更多中国患者人群数据与实践。HRD作为泛癌种的生物标志物在临床应用中还处于起始阶段，但对于泛癌种中HRD与免疫检查点抑制剂之间的相关性依然值得进一步研究。目前国内外有多个研究机构正在多瘤种中开展HRD评分状态与HR基因，与免疫检查点抑制剂单药或联合用药疗效相关性的临床试验[46]。2021年美国妇科肿瘤学会（SGO）年会上公布了一项Ⅲ期临床试验，该研究首次探索了免疫检查点抑制剂在BRCA1/2突变和HRD卵巢癌患者中的疗效，并且探索了BRCA1/2突变和HRD与肿瘤突变负荷（TMB）之间的相关性[47]。虽然HRD检测和临床应用的标准化任重而道远，但其应用前景值得期待。

3

肿瘤蛋白/代谢标志物

继续扩大蛋白质基因组研究计划的同时，本领域仍存在挑战：①将蛋白质标志物应用于临床活检规模的小样本量需要技术的进一步发展。②潜在组合标志物的筛选，需要多组学的研究和公共资源的整合。③开发更敏感特异的癌症筛查需要设计可靠可重复的临床工作流程。④未来单细胞分辨率下的蛋白质分析和整合成像数据与分子数据的人工智能技术也可预见的将在本领域发挥重要作用。同时随着检测技术的日新月异，我们相信肿瘤代谢标志物也将获得长足进展，单细胞代谢指纹图谱为肿瘤微环境的代谢标志物开辟了新方向。

4

肿瘤液体活检标志物

随着ctDNA检测技术的发展与标准化的临床应用，ctDNA标志物检测必将助力肿瘤的精准诊断、疗效监测与预后评估，指导靶向药物的合理使用，实现肿瘤的精准检测与治疗。肿瘤外泌体研究未来方向主要体现在临床应用转化方面。包括外泌体研究技术标准化，外泌体作为新型药物输送系统，如何有效提高药物装载率及靶向递送。外泌体蛋白质组学研究用于肿瘤诊断，肿瘤进展监测。外泌体/细胞外囊泡芯片的开发。外泌体交联生物传感器用于负载分子的研究和分析。

5

肿瘤单细胞标志物

尽管单细胞测序在肿瘤标志物研究中已实现了许多技术及应用突破，但目前对肿瘤内部组织及其微环境的细胞多维排布信息知之甚少。因此，需开发高分辨率空间多组学研究技术，重构肿瘤内组织及微环境中的细胞排布，实现肿瘤组织内二维、三维细胞分布及异质性解析；同时结合时间分辨单细胞测序方法，捕捉肿瘤细胞内的瞬时变化信息，实现肿瘤组织内四维时空分辨图谱绘制。

参编专家：

邢金良 空军军医大学

聂勇战 空军军医大学附属西京医院

曾木圣 中山大学肿瘤防治中心

谢晓冬 北部战区总医院

陈奎生 郑州大学第一附属医院

袁响林 华中科技大学同济医学院附属同济医院

王书奎 南京医科大学附属南京医院/南京市第一医院

辇伟奇 重庆大学附属肿瘤医院

于津浦 天津医科大学肿瘤医院

纪   元 复旦大学附属中山医院

张海伟 重庆大学附属肿瘤医院

陈   威 志诺维思（北京）基因科技有限公司

刘华文 重庆大学附属三峡医院

黄灿华 四川大学

王   智 中山大学口腔医学研究所

周圣涛 四川大学华西第二医院

刘   锐 中山大学口腔医学研究所

林树海 厦门大学生命科学学院

卢仁泉 复旦大学附属肿瘤医院

王砚春 复旦大学附属肿瘤医院

胡志远 国家纳米科学中心

张   灏 暨南大学

余幼林 武汉科技大学附属孝感医院

李   凯 暨南大学

杨朝勇 厦门大学

高友鹤 北京师范大学

黄启超 空军军医大学

郭   旭 空军军医大学

郭文杰 空军军医大学

高   天 空军军医大学

赖仁胜 昆明医科大学附属二院

参考文献：

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