由病原微生物造成的安全问题涉及面广且影响日益严重，对人类的健康和财产威胁巨大。2017年中国公共卫生事件报告统计数据显示，由病原微生物所引起的报告起数、中毒人数及死亡人数均位居首位，占比分别为57.47% (200/348)，64.8% (4793/7389)和64.29% (90/140)[1]。在短时间内准确快速地对病原微生物进行检测，从而实现对食品安全的监测至关重要，同时也是一种巨大的挑战[2−3]。在全球范围内，由病原微生物导致的疾病发病率不断攀升，给卫生系统带来了沉重负担，且大大降低了生产力。2002−2003年，由SARS冠状病毒(SARS-CoV)造成严重急性呼吸综合症的流行，2012年发现的中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)可引起严重的呼吸道疾病，这些病毒的传播在世界范围内造成了严重影响[4−7]。2019年新型冠状病毒SARS-CoV-2(COVID-19)所引起的疾病在全球肆虐，死亡人数已超过296万，并造成极大的经济损失[8]。随着新型病原微生物的出现、已知病原微生物的突变及细菌抗生素耐药性的增加，传染病的发病率和死亡率日益成为全球公共卫生的重要威胁，给医疗保健系统和社会带来巨大压力，而早期诊断是降低死亡率和医疗成本的有效方法[9−11]。因此，开发出可快速有效检测病原微生物的新型检测技术是当务之急。

迄今为止，基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的传统核酸检测技术仍是一种重要的分子检测手段，但越来越多的新型核酸检测方法及平台不断诞生与蓬勃发展(图 1)。核酸等温扩增技术、核酸杂交技术及基于CRISPR/Cas体系的核酸检测技术，为建立快速有效的检测手段开辟了新方向[12−17]。其中基于CRISPR/Cas体系开发的核酸检测方法已在传染病诊断中被广泛研究，可实现对病原微生物特异、灵敏的现场检测[18]。如，基于CRISPR/Cas技术的副溶血性弧菌检测方法[19]和基于CRISPR/Cas技术的单核增生李斯特菌的快速检测平台[20]。CRISPR/Cas技术应用于核酸检测中的前期研究主要集中在Cas9、Cas12a(Cpf1)以及Cas13a(C2c2)这3种蛋白。Cas9蛋白具有2个结构域，分别为HNH和RuvC，其依赖的原型间隔序列毗邻基序(Protospacer adjacent motif，PAM)5′富含GC，Cas9在tracrRNA (Trans-acting CRISPR RNA)及crRNA(CRISPR RNA)的引导下作用于靶标DNA。Cas12a的催化结构域为RuvC，在crRNA的引导下作用于靶标双链DNA(Double-stranded DNA，dsDNA)，其依赖的PAM序列5′富含AT。Cas13a蛋白具有2个HEPN的结构域，在crRNA的引导下作用于靶标RNA，其依赖的原间隔子侧翼位点(Protospacer flanking site, PFS)的3′端必须非G[16−17, 21−23]。近期发现的Cas14a具有RuvC的催化结构域，能够靶向单链DNA(Single-stranded DNA，ssDNA)，并且不依赖PAM[24]。随着不同Cas蛋白研究的深入，它们具有的核酸内切酶活性及附属切割活性逐渐被发现，并应用于核酸检测技术的研发中，因此基于CRISPR/Cas体系的核酸检测技术是目前乃至未来十分重要的研究方向之一。本文综述了基于CRISPR/Cas体系核酸检测方法的研究进展，重点分析了不同Cas蛋白检测标靶的特征与案例，旨在为进一步研发病原微生物的新型检测方法提供可靠依据。

CRISPR/Cas系统是由成簇、规则间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein，Cas)组成，存在于许多的古细菌和细菌中[25−26]。1987年，在大肠杆菌中发现了一组29个核苷酸的重复序列，由不相关、不重复但类似的短序列隔开[27−28]，2002年重复间隔序列被命名为CRISPR[29]。随后研究发现CRISPR间隔区与噬菌体或质粒序列之间的匹配，暗示了CRISPR基因座在防御入侵DNA中的作用，并证明该序列介导了一种适应性免疫途径[30−34]。2011年，Makarova等揭示了CRISPR/Cas系统通过适应、表达和干扰3个阶段介导的免疫机理(图 2)：在适应阶段，与病毒或质粒序列同源的短DNA片段会被整合到CRISPR自身的间隔区；在表达阶段，CRISPR基因序列的一级转录本pre-crRNA产生，并被加工成crRNA，crRNA与病毒或质粒的靶序列匹配；在干扰阶段，crRNA将Cas蛋白引导至与间隔区匹配的病毒或质粒靶序列处形成效应复合物，并利用Cas蛋白切割靶序列[21−22]。其中，PAM序列是crRNA引导Cas蛋白正确识别靶序列的必要条件[35−36]。

在CRISPR/Cas系统中存在着多样化的Cas蛋白，按照Cas蛋白的组成可以将CRISPR/Cas系统大致分为2类：第一类系统依赖的Cas蛋白为多亚基蛋白复合物，第二类系统依赖的Cas蛋白为单一效应蛋白。随着新型Cas蛋白的发现，可进一步根据Cas蛋白基因结构及重复间隔序列结构将CRISPR/Cas分为6类(Type Ⅰ-Ⅵ)，其中Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型属于第一类系统，Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型属于第二类系统[22, 38]。Cas9属于Ⅱ型，Cas12a属于Ⅴ型，Cas13a属于Ⅵ型，而这3种Cas蛋白都是单组分的效应蛋白[17]。

基于CRISPR/Cas系统的检测技术主要是利用CRISPR/Cas系统原有的适应、表达和干扰3个阶段，进行针对性的改造以实现特异性靶标的检测。通过人工设计向导RNA (Single-guide RNA，sgRNA)，使其特异性识别靶序列后，Cas蛋白裂解靶序列从而形成特异性的双链断裂(Double strand breaks，DSB)，而sgRNA的结构取决于所用的Cas蛋白[39]。CRISPR/Cas技术基于Cas蛋白的作用，不同的Cas蛋白应用于核酸检测中的机制存在差异，用于检测的CRISPR/Cas系统与Cas蛋白也具有不同的特点(表 1)。基于Cas9的核酸检测主要依赖于特异性识别靶序列的能力，针对靶标设计特异性的sgRNA，可实现对不同基因型的检测[39−40]。基于Cas12、Cas13及Cas14的核酸检测方法依赖于Cas蛋白的附属切割活性，其中Cas13靶向ssRNA，Cas14靶向ssDNA[16, 24, 38−39]。当Cas蛋白与sgRNA、靶序列形成效应复合物时，其附属切割活性被激活，对已被标记的ssRNA或ssDNA报告基因进行切割，从而释放出信号达到检测效果[40]。

随着CRISPR/Cas系统研究的不断深入，Cas蛋白的特点及功能活性被逐渐认识并应用。最初对Cas9的研究证明，RNA分子可引导Cas9蛋白识别并切割特定的DNA序列，因此，该系统被运用在基因组编辑中，从而被作为一种新型生物技术进行了广泛的研究[23, 41−42]。随后更多的Cas蛋白被发现，Cas12a、Cas13a被定义并命名。研究人员发现这些Cas蛋白属于第二类CRISPR/ Cas系统成员，并具有附属的切割活性[16−17]。最近的研究发现了CRISPR/Cas14系统，Cas14可识别靶标并触发ssDNA分子的非特异性切割[24]。CRISPR/Cas系统能够识别并切割核酸序列，因此被广泛的应用在核酸检测中。针对不同的待检病原微生物，需要选择不同的Cas蛋白。目前已知的病原微生物包括细菌、真菌、病毒等，而病毒又分为RNA病毒和DNA病毒，在已知的Cas蛋白中只有Cas13a可直接靶向RNA病毒。如果实际操作中选择其他类型的Cas蛋白，需要将待检的RNA分子反转录为DNA后，才可建立相应的检测方法。本文将基于不同Cas蛋白的活性，分别举例介绍其在核酸检测中的应用(图 3)。

2016年，Collins等首次将CRISPR/Cas技术应用于核酸检测中，成功地将NASBA (Nuclear acid sequence-based amplification)与Cas9效应蛋白整合在一起，开发了检测寨卡病毒的纸基传感器(NASBA/CRISPR cleavage，NASBACC)，实现了对不同寨卡病毒亚型的有效区分[47]。该方法首先对目标RNA进行扩增，将扩增产物添加至纸质传感器上打开发夹结构，LacZ合成被激活发生生化反应，进而产生黄色到紫色的颜色变化，肉眼即可进行观察。随后根据CRISPR/Cas9系统对PAM序列优异的识别能力，该检测平台设计了一个特异的sgRNA，其特异性识别所依赖的PAM序列只存在于美国寨卡病毒基因组中但不存在于非洲寨卡病毒基因组中，因此Cas9对不同的基因型表现出不同的切割活性，可对寨卡病毒的不同亚型进行精确区分。该系统可进行单碱基的识别，并在3 h内得到检测结果。

对Cas9的2个核酸酶结构域进行突变，得到了失去剪切能力的dCas9(Nuclease-deactivated Cas9)[48−49]。利用dCas9对序列的识别作用，一种基于荧光素酶修饰dCas9蛋白的核酸检测方法被开发，实现了对结核分枝杆菌的检测[50]。该方法将荧光素酶分为2个部分(N端部分与C端部分)，分别与2个dCas9蛋白融合。通过设计特异的二重体sgRNA，当2个dCas9同时识别并结合靶标时，使荧光素酶两个部分的距离拉近，恢复其催化活性从而发光以达到检测效果。目前miRNA检测中存在程序复杂、成本高和灵敏度低等问题，为此研究人员建立了一种基于CRISPR/Cas9的RCA-CRISPR-HRP(RCH)检测方法(图 3A)，以实现低成本和高效率的检测[43]。该方法不仅成本低(每次检测费用低至1.727美元)，还可实现fM级和单碱基差异miRNA的检测，整个检测流程可在4 h内完成。

Cas12a蛋白又被称为Cpf1蛋白，属于第二大类CRISPR/Cas的Ⅴ型系统[16]。在RNA的引导下，该蛋白能够特异性结合并切割外源DNA。2018年，Chen等研究发现，当CRISPR/Cas12a蛋白以序列特异性的方式切割dsDNA时，会诱发强烈的、非特异性ssDNA的反式切割。作者利用Cas12a这一附属切割活性开发了一种准确快速的检测方法。该检测方法将Cas12a与等温扩增相结合，命名为DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)，并实现患者样品中人乳头瘤病毒(HPV)高灵敏检测[51]。从肛门拭子中提取HPV的dsDNA，通过重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)进行扩增，再将Cas12a-crRNA复合物和可进行荧光淬灭的ssDNA探针加入反应体系。Cas12a-crRNA复合物结合并切割目标HPV的dsDNA，而激活Cas12a的反式切割，即对ssDNA探针进行切割，ssDNA的荧光报告基因在切割后产生荧光信号。DETECTR实现了从多种不同的人乳头瘤病毒亚型中准确检测出HPV16和HPV18，具有高特异性。后续研究中为提高检测灵敏度与特异性，并减少检测时间及反应过程中的污染，在DETECTR的基础上提出了1种称为Cas12aVDet的检测方法。该检测方法通过将RPA与Cas12a切割活性进行整合在一个系统中反应，将检测时长从2个小时缩短至半个小时内[52]。

基于Cas12a对非靶向ssDNA的反式切割活性，Li等采用荧光淬灭ssDNA报告基因作为探针开发了HOLMES (An one-hour low-cost multipurpose highly efficient system)，能够用于快速检测目标DNA和RNA[44]。利用PCR或其他等温扩增技术对靶DNA进行扩增，并以靶DNA为目标设计对应的crRNA向导序列。当存在目标DNA时，Cas12a-crRNA与靶标结合形成Cas12a复合物，其反式切割活性被激活，ssDNA报告基因被切割释放荧光信号。通过对目标DNA序列(包括PAM序列和向导序列)的不同位置进行点突变，观察荧光信号输出强度的变化，证明了该方法可以区分单碱基差异，实现了人类基因型中SNP的高效检测(图 3-B)。HOLMES用于检测DNA病毒和RNA病毒，检测限可以低至1-10 aM，可实现单分子检测，且不需要昂贵的试剂和专业仪器，成本低廉。

Cas12b(C2c1)源自VB型的CRISPR/Cas系统，研究人员基于Cas12b开发了HOLMESv2系统，该系统可区分SNP，检测RNA病毒、人类细胞mRNA和环状RNA，并定量目标DNA及其在不同人类细胞系中的甲基化程度[53]。此外，研究人员还开发了一种Cas12b介导的DNA检测方法(Cdetection)，通过结合优化的向导RNA可以实现单碱基水平的差异区分。与基于Cas12a的检测平台相比，该策略对被检测的靶标显示出了更高的灵敏度[54]。

Cas13a蛋白也被称为C2c2蛋白，属于第二大类的Ⅵ型系统。2005年，通过对候选的第二大类的CRISPR/Cas系统进行计算和预测，得到了以Cas13a蛋白为代表的新一类Ⅵ型CRISPR/Cas系统[17]。Cas13a蛋白在RNA的引导下，形成功能性复合物并与靶标RNA识别，随后激活Cas13a的非特异性反式切割活性，能够对任意单链RNA进行切割。根据Cas13a的性质，研究人员设计了基于CRISPR/Cas13a系统的检测平台，并命名为SHERLOCK (Specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)。该检测方法可进行单分子的RNA分子检测，每个测试的成本低至0.61美元[45]。Cas13a识别的靶标为RNA，因此在对DNA进行检测时，需要将DNA转录成RNA后再进行检测(图 3C)。与DETECTR类似，SHERLOCK将RPA和RNA引导的Cas13a结合在一起，诱导了非靶标链的反式切割。利用RPA等温扩增技术对样品中的靶标进行富集并转录成单链RNA，随后加入Cas13a-crRNA复合物和荧光RNA探针。当Cas13a-crRNA结合靶标RNA时，Cas13a的附属切割活性被激活，会对周围的荧光RNA探针进行切割产生荧光信号。在SHERLOCK中，与荧光报告分子偶联的RNA被切割，产生的荧光信号通过酶促活性被放大，从而增强了检测灵敏度(可实现单分子的核酸检测)。研究人员不仅实现了对寨卡病毒(ZIKV)和登革热病毒(DENV)的检测，还表示该技术可用于检测感染的病毒和细菌等病原体，并且能够进行人类基因分型及检测无细胞等位基因SNP等[45]。

2018年，Myhrvold等介绍了一种新的方法用于释放和保护来自临床样本的病毒核酸，避免了在分子诊断中提取核酸的需要，这种方法被称为HUDSON (Heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases)。该方法通过加热和化学还原来裂解病毒颗粒，并使体液中大量的核糖核酸酶(RNase)失活，从而将核酸释放到溶液中[55]。作者将HUDSON与SHERLOCK相结合，开发了一个灵敏、特异的检测平台，在有限的样本及设备要求情况下，可以直接从体液(尿、唾液、血清、血浆和全血)中检测出ZIKV和DENV，1–2 h内即可得到结果。

高度多样化的Cas蛋白具有不同的活性，对于核酸检测和应用是有利的。目前主要研究的3种Cas蛋白不仅可以单独地应用于核酸检测，而且基于其靶标底物的不同可以进行组合使用。Gootenberg等于2018年开发了升级版的SHERLOCK(SHERLOCKv2)，可以实现在单个反应中检测3个ssDNA靶标和1个dsDNA靶标[56]。研究人员对17种CRISPR/Cas13a和/Cas13b酶进行了生化鉴定，选择了3种具有不同切割偏好的Cas13蛋白(LwaCas13a、PsmCas13b和CcaCas13b)与Cas12a和RPA结合使用，每一种扩增的核酸靶标与对应的Cas-crRNA相结合，可激活对应Cas蛋白的活性而切割其对应的特异性底物，从而产生多种不同的荧光响应，实现对不同靶标的检测。该检测方法可以在90 min内通过视觉读数准确检测ssRNA。通过与CRISPR相关酶Csm6的结合，SHERLOCKv2实现检测信号的进一步放大，极大地提高了检测灵敏度。基于该检测方法进一步设计了检测试纸条，实现了检测信号的可视化输出，不需要仪器辅助即可进行检测结果的裸眼观察。

近期研究人员发现了CRISPR/Cas14系统，该系统包含的Cas14a可以靶向ssDNA序列，并且具有由靶标介导激活的附属活性[24]。附属活性被激活后，Cas14a可以靶向附近的其他ssDNA分子。研究人员基于Cas14开发了一个名为Cas14-DETECTR的检测方法(图 3D)，可以对ssDNA进行检测，在无需PAM序列的限制下即可对SNP进行高保真检测。利用该系统可以实现多重方式靶向不同的ssDNA，因此可针对以ssDNA作为遗传物质的病毒等开发核酸检测技术及平台，从而有效应用在分子诊断领域[46]。

目前，传统培养方法仍是临床上检测病原微生物的金标准，通常需要5–7 d时间，且仅限于可培养的病原微生物[57]。作为分子检测方法广泛使用的实时定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)，虽然具有快速、经济、灵敏度较高的优势，但需要专业人员及昂贵的仪器才能获得准确可靠的结果[58−59]。CRISPR/Cas技术在核酸检测中主要应用于核酸扩增后信号进一步放大和信号转化及输出，其中主要利用Cas蛋白特异性识别PCR扩增产物以激活切割活性，并作用于设计的底物而将信号以荧光等方式输出达到信号放大的效果。例如，葡萄红斑病毒是1种单链环状DNA病毒，为解决葡萄红斑病毒感染所造成的经济损失，Li等开发了一种利用CRISPR/Cas12a与金纳米等离子体的比色识别法对葡萄红斑病毒进行检测[60]。该检测方法将CRISPR/Cas12a技术应用于检测到目标DNA后的信号转化及输出步骤。sgRNA特异性识别靶标后，Cas12a对设计的底物S进行切割，直接实现了通过裸眼观察颜色变化来直接判读检测结果。在对新型核酸检测技术的迫切需求下，CRISPR/Cas技术被更多地应用于核酸检测中，所建立的检测系统也各有不同(表 2)。

比较已开发的基于CRISPR/Cas技术的核酸检测方法，大多都具有以下优点：操作简便易于开发，对单碱基突变有很高的分辨率，一般能达到aM级别的检测限(10−18 mol/L；如SHERLOCK平台可达到单分子检测级别)，不需要专业仪器，可通过可视化进行信号读取，能够实现定量检测及多重检测等。如对葡萄红斑病毒设计的比色识别法中，CRISPR/Cas12a技术与PCR扩增技术相结合，检测限可达1×102 aM，且核酸样品经过2×103–1×104次稀释也能获得准确的检测分析结果[58]。该方法的检测灵敏度高，并能克服在样品预处理过程中不可避免的目标DNA损失。本团队前期工作研发了基于CRISPR/Cas12a技术的荧光和电化学传感器检测平台，实现了食品样品中对单增李斯特菌的有效检测[20, 63]。而开发的基于CRISPR/Cas12a技术的荧光检测平台在检测单增李斯特菌4c血清型时，相较于传统的RT-PCR方法具有更高的特异性及灵敏度[20]。这些核酸检测技术为即时和现场检测提供了可能性，且当样本量低或者样品未处理时，基于CRISPR/Cas开发的核酸检测技术也能发挥作用，这使得在资源有限的情况下也可实现高效的核酸检测[64]。同时，对CRISPR/Cas系统的继续深入研究无疑会发现更多有价值的Cas蛋白，而这些蛋白可进一步用于提高检测的灵敏度和稳定性。毫无疑问，CRISPR/Cas系统的发展将为核酸检测技术带来更多的创新和可能性。对于不同来源的样品，基于CRISPR/Cas技术的核酸检测技术可快速、灵敏、便捷地鉴定其病原微生物，从而在不同研究领域实现多种检测应用，具有巨大的发展潜力[39]。

虽然基于CRISPR/Cas开发的新型核酸检测技术显示出诸多优势，但同时也存在一定的局限性。crRNA引导Cas蛋白对靶标的识别和切割存在2个要求：(1) crRNA和靶标序列之间的碱基配对；(2) 需要靶标序列3′端有合适的PAM序列。如，Cas9所需的PAM序列为NGG(其中N代表A、T、C、G)，这样的PAM序列在核酸序列中出现的概率是1/4(G)*1/4(G)=1/16[65]。此外，Cas9识别双链DNA，因此在基因组中平均每8个碱基对中就会出现一个NGG序列。当针对某一基因的识别时，可从中找到具有合适PAM区域的靶标序列。但在基于SNP或者其他的短序列的检测时，存在的选择很少，对应Cas蛋白的特定PAM序列要求很难满足。例如，基于Cas9的NASBACC的检测方法需要在PAM序列中进行突变以精确区分病原微生物基因型[47]。HOLMES的检测方法考虑到SNP位点附近没有合适的PAM序列，因此专门设计了用于PCR扩增的引物以引入PAM序列[44]。同时，向导序列的长度、靶标结合位点与PAM序列的距离对检测中的信噪比也有着显著影响。对于定量检测以及对多种目标物的同步检测技术较少且存在限制，需要开展更深入的研究，并探索合适的检测策略。

随着基于CRISPR/Cas的核酸检测技术在各个领域的应用，对样品预处理的方法和全过程进行实时监测需要进行完善[20, 40]。因不同的Cas蛋白针对的靶标存在差异，结合靶标的能力也不同，因此针对不同目标物的通用型检测平台有待开发。在实验室环境中开发的检测技术，在改变应用环境时其检测效果有待进一步观察。

基于CRISPR/Cas技术的核酸检测为全球的公共卫生带来巨大的影响，对于实现快速、灵敏、稳定、准确的即时现场检测潜力巨大，有望为全球各地因病原微生物感染导致的疾病带来更加便捷、高效、成本低且实用的诊断工具[66]。对于开发基于CRISPR/Cas的核酸检测技术时，针对待检样品的核酸类型，是否需对不同的DNA靶标或RNA靶标进行同步检测，序列中是否存在PAM序列，以及对输出模式和灵敏度等存在不同的需求时，需要对这些技术中可能存在的优缺点进行综合考虑与评估，以选择最优的检测策略。

CRISPR/Cas技术在核酸检测中发挥了重要的作用，无论是从各个性能指标上的提升还是为核酸检测提供的新思路，都使基于CRISPR/Cas技术的核酸检测朝着更快速、准确、便捷、灵敏的方向发展。基于CRISPR/Cas的核酸检测技术可以实现病原微生物核酸aM级别的检测，与传统PCR的fM检测限相比，具有更高的灵敏度[45, 67]。即时检测鉴定目标病原微生物是实现疾病控制和治疗的关键，而开发快速、灵敏、准确的现场检测技术与平台将改善病原微生物的检测、鉴定和风险控制。目前，现场检测仍存在着许多局限，包括灵敏度、成本以及对设备和专业人员的需求等。基于CRISPR/Cas技术的核酸检测技术可提供快速、灵敏、现场、特异的定量分析与多重分析，通过合理地设计sgRNA序列即可实现对不同靶标的检测。同时不需要繁琐的操作处理及昂贵的辅助仪器，可通过荧光、电化学及可视化等方法进行信号读取。对人体、动植物、食物及环境等各种样本中病原体的检测表现出巨大的发展潜力，实现高效、低成本、简单且易于读取的即时诊断。CRISPR/Cas系统更多功能的发现，将为核酸检测技术的研究提供更多新工具，对实现病原微生物的精准检测、监测与控制具有重要意义。

目前，基于CRISPR/Cas的核酸检测技术主要包括目标物扩增与Cas蛋白介导的信号检测两个部分。在实际过程中，由于两部分的反应最适温度不同，反应体系对酶活力影响较大，通常采用两步法进行检测平台的搭建。但分步的操作较繁琐且易造成污染，对于实现检测单分子仍存在隐患。为避免以上问题，搭建一步法的检测平台是未来的重要发展方向，其中对于最适温度的选择、如何保持最佳酶活力、减少反应体系对Cas蛋白活性的影响等都是研究重点。随着基于CRISPR/ Cas技术的核酸检测平台的不断发展，未来在食品安全、疾病诊断等领域将发挥更重要的作用。