基因编辑技术是近年来兴起的一项分子生物学技术，主要通过利用序列特异性的核酸酶在DNA特定位点引入或缺失碱基，产生高频诱导突变，对目标基因或特定DNA片段进行“编辑”，从而实现对目标基因或特定DNA片段的敲除或加入。由于此技术在医学、农业和工业等领域具有广阔的应用前景，引起了广大科技工作者的关注。

基因编辑技术的发展大致经历了3个阶段。第一代技术主要指锌指核酸内切酶（zinc finger nucleases, ZFN）编辑技术，是第一个设计出能在特定DNA序列切割的人工核酸酶。锌指DNA结合蛋白与FokⅠ核酸内切酶融合行使切割作用，在特定的位点产生突变。但ZFN编辑技术因其结构复杂、重复单元有限、高频脱靶及细胞毒性等不足，最终没有被广泛应用[1-2]。第二代技术是以类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases, TALEN）为代表的编辑技术。类转录激活因子效应物（transcription activator-like effector, TALE）是天然的细菌效应蛋白，能在宿主植物体中调控基因的转录[3]。TALEN由TALE结合结构域与FokⅠ核酸内切酶结构域融合组成，与ZFN技术相比，具有设计容易、突变率高等优点，因此对其报道相对较多。第三代技术是CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas，成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas）编辑技术，因其具有成本低、制作简便、快捷高效等优点，迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具[4-5]。鉴于目前CRISPR/Cas9技术已经在生命科学各研究领域中广泛使用，并且国内在医学领域已有一些较好的中文综述[6-7]，因此本文在扼要介绍CRISPR/Cas系统的基础上，着重介绍CRISPR/Cas9的作用原理及其在作物中的应用。

CRISPR/Cas系统最早是在细菌的天然免疫系统中发现的，主要用于对抗入侵病毒或外源DNA。1987年，日本学者在研究大肠埃希菌编码的碱性磷酸酶基因编码区时，发现其下游区域有29 bp的重复片段和32~33 bp的间隔片段相连的重复序列，即所谓的“成簇的规律间隔的短回文重复序列”（CRISPR）[8]。该序列于2002年被正式命名为CRISPR[9]。目前已知的90%古细菌和40%真细菌的基因组均含有CRISPR/Cas系统，这是古细菌和真细菌在进化过程中形成的一种获得性免疫系统[10]。CRISPR/Cas系统均由CRISPR关联基因（CRISPR associated, Cas）编码的RNA指导的核酸内切酶、相似的回文重复序列和非编码的短RNAs组成[11]。不同CRISPR/Cas系统的重复序列长度大致为23~47 bp。在同一物种中，CRISPR的重复序列是高度保守的，在一些近缘种间也具有一定的相似性。

CRISPR/Cas系统的基本结构由CRISPR基因[包括前导序列（leader sequence）、重复-间隔序列（repeat-spacer sequences）和回文重复序列（palindromic repeat sequences）]、Cas核酸内切酶基因和不编码的RNA[包括CRISPR来源的RNA（CRISPR-derived RNA, pre-crRNA）和反式激活crRNA（trans-activating CRISPR RNA, tracrRNA）]组成（图 1）。前导序列是一段与转录有关的保守序列，位于CRISPR上游。间隔序列由病毒或质粒的核酸衍生而来，常被用作识别元件去寻找与之相匹配的序列并摧毁它。回文重复序列对于间隔序列在基因座的位置和方向起决定性作用[12]。原间隔序列（proto- spacers）位于原间隔序列毗邻基序（protospacer adjacent motifs, PAM）两侧，并在免疫的第一阶段产生间隔序列。Cas蛋白复合体是由CRISPR基因附近的一个基因簇编码，具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性和各种RNA结合蛋白特性的结构域[13]。由于Cas蛋白复合体与CRISPR基因共同进化、共同发挥作用，因而被命名为CRISPR关联基因。在原核基因组中，目前已知的Cas蛋白家族有40多个，在crRNA形成、外源DNA的整合和剪切中发挥重要作用[14]。tracrRNA位于CRISPR关联基因Cas及前导序列-重复-间隔序列阵列链的反方向，介导非编码RNA（precrRNA）的成熟以获得crRNA[15]。

目前已知，不同真细菌或古细菌在系统进化过程中分离出多种CRISPR/Cas系统，可分为2大类别、共16种CRISPR/Cas子型免疫系统[13]。其中：类别1包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型共12种CRISPR/Cas系统，需多个Cas蛋白组成的复合体共同发挥作用；类别2包含Ⅱ和Ⅴ型共4种CRISPR/Cas系统，只需1个Cas蛋白效应器。Cas9、Cpf1、C2c1和C2c3是类别2中已知的核酸内切酶蛋白[16]。

Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型是CRISPR/Cas系统中最经典的3种类型[17]，这3类系统均含有成簇的规律间隔的短回文重复序列、操纵子操纵的基因（Cas）和决定切割位点特异性的非编码RNA，并且分别拥有各自独特的Cas效应蛋白，如Ⅰ型Cas3、Ⅱ型Cas9和Ⅲ型Cas10[18]。Ⅰ和Ⅲ型系统具有一些相同的特征，利用Cas6核酸酶加工前体crRNA，待前体crRNA成熟以后，每个crRNA聚集到由多个Cas蛋白组成的复合体中，然后识别并切割与crRNA互补的核苷酸链[19]。Ⅱ型CRISPR/Cas系统是从化脓链球菌中分离出来的免疫系统，如CRISPR/Cas9系统，这种类型只需1个Cas9蛋白即能在特定位点发挥基因编辑效应。大多数Ⅰ型CRISPR系统中的Cas2和Cas3蛋白分别参与到外源基因的适应和干扰阶段。但是在绿脓假单胞菌分离出的Ⅰ-F系统中，这些蛋白融合成1个多肽，Cas1亚基抑制Cas2/3核酸酶活性，由Csy复合物识别外源DNA并激活Cas2/3核酸酶活性，诱导DNA双向降解[20]。

此外，最近有研究者从细菌中分离出了2种新型CRISPR/Cas系统：CRISPR/CasX和CRISPR/ CasY[21]。在CRISPR/CasX系统中，CRISPR阵列编码Cas1、Cas2、Cas4和Casx 基因，CasX蛋白仅有RuvC核酸酶结构域。而CRISPR/CasY系统较特殊，CRISPR阵列中的间隔序列比所有已知的CRISPR系统短，并且CasY蛋白结构域仅与C2c3的RuvC核酸酶相似。

在众多CRISPR/Cas系统中，迄今为止对CRISPR/Cas9系统的功能研究最多，对其作用原理的剖析也相对较为透彻。因此，本节将主要介绍其分子作用机制。

从酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）中分离出的Ⅱ型CRISPR系统主要由3个作用元件组成：Cas9蛋白、crRNA和trancrRNA。不同物种的Cas9蛋白氨基酸长度在950~1 600之间[22]。目前已知，Cas9蛋白具有HNH和RuvC 2个核酸酶结构域，分别切割DNA靶位点对应的2条单链[23]。另外，Cas9核酸酶具有2个功能：识别间隔毗邻基序PAM，并与sgRNA、靶位点DNA互作。tracrRNA序列与precrRNA转录的重复区域互补结合，从而介导precrRNA的加工并释放出成熟的crRNA。此过程需要RNA聚合酶Ⅲ和Csn1的参与。在Csn1存在的情况下，引导双链RNA被识别并由RNase在其特定的位点切割成多个单元。这些独立的单元经进一步加工，最终形成成熟的crRNA。在核内小RNA（snRNA）启动子U6或U3存在的情况下，crRNA与trancrRNA配对形成单向导RNA（single guide RNA, sgRNA），可有效表达[24]。sgRNA是一个由crRNA:tracrRNA双链融合形成发夹结构的嵌合体，由小于100 bp的短序列编码。sgRNA的PAM 5'- NGG-3'序列上游的20 bp序列决定了CRISPR/cas9系统靶位点的特异性[25]。Cas9与crRNA:tracrRNA组成的复合物对PAM的识别是DNA解旋和靶位点片段与sgRNA形成杂合结构的先决条件[26]。PAM的典型序列为“5'-NGG”，但不同系统的PAM序列和位点有所不同，比如“5'-NNAGAA”“5'-NGGNG”或“5'- NNNNGATT” [11]，这可能与R环（R-loop）结构的形成有关[27]。

在CRISPR/Cas9系统中，位点特异性的断裂是由crRNA、靶位点间隔序列DNA及间隔序列毗邻基序PAM之间的互补性决定的[28]。sgRNA序列中的20 bp序列是在基因组中所要寻找的目标靶序列。一旦靶序列与sgRNA互补配对，激活Cas9识别crRNA和靶基因上游的基序PAM，从而导致蛋白构象发生改变。Cas9蛋白的2个核酸酶结构域在PAM上游的3~4 bp处产生平末端的双链切口[29]，其中，RuvC核酸内切酶切割与crRNA互补的靶序列单链，而HNH核酸内切酶切割对应的非互补单链[30]（图 2）。双链断裂同时诱导2种不同的修复机制：同源重组（homology-directed repair, HDR）和非同源重组（non-homologous end joining, NHEJ）。非同源重组是体细胞中最常见的易错修复机制，往往会出现缺失、插入、染色体倒置和易位等现象，而同源重组很少出错。因此，利用外源提供的DNA模板可在双链断裂位点提高基因编辑的精确性和实现特定位点基因的插入[31-32]。有研究发现，在水稻和拟南芥中，64%~75% CRISPR编辑产生的突变体为单碱基缺失或插入[33]；因此，理论上可通过设计不同的sgRNA，由Cas9核酸酶识别任何带有PAM并与sgRNA特异性互补的靶位点，实现对目标基因不同程度的编辑。

在细菌中，不同种类的CRISPR/Cas免疫机制主要包括间隔序列获取、crRNA形成和干扰3个阶段[34-36]。在间隔序列获取阶段，Cas1/Cas2蛋白辅以Cas4（Ⅱ-B和Ⅱ-C中Cas4的同源蛋白）、Csn2（Ⅱ- A）和Cas9（Ⅱ-A）参与外源核苷酸片段（原间隔序列）插入到重复间隔序列中成为新间隔序列。这些新的间隔序列成为外源因子再次入侵细菌的“分子记忆”；当再次入侵时，沉默外源核苷酸片段。原间隔序列的识别需要靶位点毗邻的PAM（NGG）序列[37]。在crRNA形成阶段，无论是Cas6核酸内切酶（Ⅰ和Ⅲ）或Cas9与tracrRNA、RNA核酸酶Ⅲ的作用（Ⅱ），还是Cpf1（Ⅴ-A）、C2c2（Ⅵ）在串联区域发挥作用，都能使pre-crRNA分子加工形成成熟的crRNA。在干扰阶段，Cas蛋白通过识别原间隔基序PAM来结合与crRNA互补的靶位点序列。Cas3（Ⅰ）、Cas10（Ⅲ）、Cas9（Ⅱ）和Cpf1/C2c1（Ⅴ-A/B）利用各自的核酸酶结构域在靶位点区域切割双链[38-39]。

最近的研究发现，从氨基酸球菌属中分离出的CRISPR/Cpf1(Ⅴ-A)系统在哺乳动物特定位点中的编辑效率更高[40]。单个crRNA、重复序列与间隔序列有效地引导AsCpf1核酸内切酶在特定靶位点切割DNA双链[41]。AsCpf1是核糖核酸酶（也称Cas12a），仅有1个RuvC核酸酶结构域。Cpf1与Cas9蛋白的区别在于：1）Cpf1仅由crRNA向导，不需要tracrRNA参与；2）Cpf1所需的crRNA序列长度短；3）Cpf1识别富含T的PAM（5'-TTTN-3'），但Cas9识别富含G的PAM；4）Cpf1在PAM远端断裂产生黏性末端，而Cas9在PAM近端产生平末端；5）Cpf1核酸酶可加工crRNA阵列以获得成熟的crRNAs[42-43]等。

对作物关键功能基因的挖掘与利用是作物产量和品质遗传改良的重要途径，但获得功能缺失突变体是基因遗传功能鉴定的必要前提。EMS诱变、T-DNA插入突变、转座子插入突变和RNA干涉等传统的遗传学研究策略，因其突变位点随机性的特点大大限制了目标基因的功能鉴定。而CRISPR/ Cas基因编辑技术具有高效、定向突变等优点，几乎可以定向敲除任何一个功能基因，因此在作物关键功能基因的挖掘与利用研究领域中显示出巨大的应用前景，倍受广大植物学家的青睐。近年来，CRISPR/Cas系统在模式植物拟南芥和烟草等农作物中已有较好的应用，本节集中介绍CRISPR/Cas系统在一些重要农作物中的应用。

目前，水稻（Oryza sativa）是CRISPR/Cas9应用最成功的作物之一。有研究表明，在CRISPR/Cas9介导的T0代突变体中，获得纯合体或双等位基因的概率高达90%[30]。LOWDER等[44]根据水稻目的基因OsYSA 和OsROC5 的序列，分别设计了由U6和U3启动子介导产生的sgRNA，这2个突变体分别表现出白化幼苗和叶卷曲等表型，经测序发现突变体靶位点缺失200 bp片段。同样，水稻基因OsPDS或OsBADH2经CRISPR/Cas9介导敲除后的突变体表现出白化矮小表型[45]。野生型水稻叶片呈现紫色，由CRISPR/Cas9介导的同时敲除OsGSTU、OsMRP15 和OsANP 基因后，导致其突变体叶片呈现绿色[46]。利用CRISPR/Cas9系统敲除CAO1 和LAZY1基因后，cao1突变体叶片呈浅绿色，lazy1突变体分蘖较分散[47]。OsNramp5 经CRISPR/Cas9敲除后，水稻谷粒中的镉含量显著降低[48]。利用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1系统分别敲除水稻OsEPFL9 基因，发现其叶片气孔密度均显著下降[49]。经CRISPR/Cas9敲除OsHAK1 后，水稻突变体的铯含量显著下降[50]。但OsDERF1 和OsMYB1经CRISPR/Cas9敲除后，水稻植株的生长发育却没有受到任何影响[33]，这可能与基因功能丰余有关。此外，CRISPR/Cas9系统也能有效编辑miRNA基因家族。有研究表明，CRISPR/Cas9通过诱导大片段缺失可敲除OsMIR528的功能，导致Osmir528突变体对盐胁迫表现为敏感[51]。综上表明，CRISPR/ Cas9系统能高效地定向编辑水稻基因组，相关分析结果总结见表 1。

小麦（Triticum aestivum）是由A、B和D 3个亚基因组组成的异源六倍体单子叶作物，但其染色体多倍性、基因组大、重复序列含量高等特点大大限制了传统基因功能修饰技术的应用，如病毒诱导的基因沉默和RNA干涉等。但是，CRISPR/Cas系统能同时敲除多个同源等位基因，从而有效地克服了染色体多倍性问题（表 1）。小麦α-麦醇溶蛋白家族是与麸质过敏症及非麸质过敏症相关的主要蛋白家族，用传统的诱变或植物育种方法都无法得到麸质低敏感性的小麦品种。而SÁNCHEN-LEÓN等[52]利用CRISPR/Cas9系统对α-麦醇溶蛋白基因实行定向敲除，设计了2条不同的sgRNA（sgAlpha-1和sgAlpha-2），并分别对BW028/TAH53 2个小麦品系及硬质小麦DP进行育种改良，得到的缺失/插入突变体与野生型相比显著降低了α-麦醇溶蛋白含量，并且这种性状可稳定遗传。同样，MORRAN等[53]利用CRISPR/Cas9系统成功编辑了小麦干旱反应因子结合蛋白TaDREB2和乙烯响应因子TaERF3。已知抗病基因TaEDR1 对小麦抗白粉病起负调控作用，当EDR1通过EDR4招募到真菌入侵位点后，与MKK4/MKK5互作负调控MPK3和MPK6的蛋白水平及激酶活性，从而影响植株免疫能力[54]。利用CRISPR/Cas系统同时敲除小麦TaEDR1的3个同源基因后，三突突变体表现出对白粉病的抗性[55]。小麦TaMLO 基因编码抗白粉病的蛋白因子，小麦共有3个MLO 同源基因（TaMLO-A1，TaMLO-B1 和TaMLO-D1）。WANG等[56]利用TALEN系统或CRISPR/Cas系统成功编辑了TaMLO-A1基因。此外，UPADHYAY等[57]利用CRISPR/Cas系统也成功制备了小麦inox 和PDS 基因的功能缺失突变体。这些研究结果充分表明，CRISPR/Cas系统在多倍体小麦基因功能研究中具有重要的应用价值。

与水稻、小麦相似，CRISPR/Cas编辑技术在玉米（Zea mays）中也得到了较好的应用，尤其在玉米雄性不育、木质素合成、抗除草剂、次生代谢物的二次代谢和耐旱性等方面已经取得可喜的研究成果[31, 58]（表 1）。玉米ZmARGOS8是乙烯应答反应的负调控因子。在干旱条件下，过表达ZmARGOS8能提高玉米转基因植株产量。利用CRISPR/Cas9系统诱变ZmARGOS8，使突变体在玉米启动子GOS2介导下持续表达ARGOS8，会使突变体植株产量明显增加[58]。玉米IspH蛋白合成基因Zmzb7 和内源基因PSY1 经CRISPR/Cas9系统编辑后，突变体幼苗均表现出白化表型[59-60]。同样，玉米乙酰乳酸合酶基因ZmALS2 和雄性育性基因ZmMS45经CRISPR/Cas9编辑后，突变体分别表现出氯磺隆抗性和雄性不育表型[31]。

大豆（Glycine max）是二倍体双子叶作物，尽管CRISPR/Cas9基因编辑技术发展很快，但是在大豆作物中的应用却很少。当前对大豆功能基因研究仍依赖于T-DNA插入突变技术，同样存在突变随机性的问题。从表 1中可以发现：大豆GmPDS基因经TALEN和CRISPR/Cas9系统编辑后，获得了白化矮小植株表型[61]；同样，大豆GmALS1基因经CRISPR/ Cas9系统编辑后，植株获得了氯磺隆抗性[62]。最新的研究表明，利用CRISPR/Cas等基因编辑系统成功地提高了大豆的干旱抗性、种子出油量和抗除草剂的能力[63-64]。

番茄（Solanum lycopersicum）是一种多肉质的双子叶经济作物。利用CRISPR/Cas9系统改良番茄产量和品质也有不少成功报道（表 1）。CLAVATAWUSCHEL（CLV-WUS）是控制分生组织大小的重要信号途径。番茄SlCLV3功能缺失引起茎分生组织膨大，从而导致花和果实发育缺陷[65]。而RODRIGUEZ-LEAL等[66]利用CRISPR/Cas9系统，对番茄SlCLV3启动子序列（2 kb）的不同靶位点进行编辑，获得大量等位突变体，通过筛选获得高产突变株系，为作物产量数量性状遗传育种提供了新途径。同样，番茄控制单性结实的基因SlIAA9经CRISPR/Cas9编辑后，突变体表现出单性结实、单叶等表型[67]。番茄慢成熟SlALC基因经CRISPR/Cas9编辑后，突变体推迟了早熟及果实颜色变化，但并不影响成熟时间和成熟时的颜色[68]。SlMAPK3基因是番茄干旱胁迫响应的正调控因子。经CRISPR/Cas9敲除后，Simapk3突变体表现出叶子枯萎和茎弯曲等干旱敏感表型[69]。番茄SlPDS和SlPIF4经CRISPR/Cas9敲除后，slpds突变体出现白化苗，而slpif4突变体表型没有明显改变，这可能与基因丰余有关[70]。

棉花（Gossypium hirsutum）是我国重要的经济作物，是由A和D 2个亚基因组组成的异源四倍体。GhMYB25-like基因对棉花纤维的发育具有重要调控功能。LI等[71]利用CRISPR/Cas9系统和拟南芥Pol Ⅲ启动子U6-26p和U6-29p，分别设计GhMYB25-like-sgRNA1及GhMYB25-likesgRNA2，获得多个缺失/插入突变体。陆地棉的2个GhARG同源基因经CRISPR/Cas9敲除后，抑制了精氨酸酶活性，但激活了一氧化氮合酶的活性，从而诱导精氨酸合成更多的一氧化氮（NO），最终促进侧根的形成[72]。棉花内源性基因GhCLA1经CRISPR/Cas9编辑后，75%的T0代植株呈现出白化苗表型[73]。而CHEN等[74]利用CRISPR/Cas9系统对GhCLA1和液泡膜焦磷酸酶基因GhVP同时进行编辑，成功获得缺失/插入突变体（表 1）。这些研究结果充分暗示，CRISPR/Cas基因编辑系统对多倍体双子叶植物也是行之有效的。

油菜（Brassica napus）是重要的含油种子作物。油菜与棉花都是异源四倍体作物，具有序列相似性的多基因拷贝数的特点。CRISPR/Cas9系统的应用，使油菜基因功能的研究和作物改良成为可能。而且，可借助一定的手段提高敲除效率，例如：从特定网站（http://cbi.hzau.edu.cn/crispr）获取sgRNAs、选取启动子和高GC含量，这些通常与高突变率相关[75]。在油菜作物中，由于基因的高拷贝性，致使一个基因家族的旁系同源基因常常具有功能丰余性，因此，单个基因的敲除并不能引起表型的变化。近年来，CRISPR/Cas9编辑技术在油菜中的应用报道较少，但也有突破性的进展，如BARRTZ等[76]发现，BnALC基因与果荚瓣膜边缘的发育有关，经CRISPR/Cas9敲除后，增强了抗破碎性，从而避免了机械收获期间的种子损失。

尽管CRISPR/Cas基因组编辑技术在作物遗传改良中具有传统方法无法比拟的优点，但目前仍存在一些不足，尤其在多倍体作物中的实际应用仍受到了一定限制。比如，多倍体结构中基因组修饰特异性的降低，以及多基因组位点的高拷贝数均增加了脱靶的概率。因此，CRISPR/Cas基因编辑系统的脱靶事件引起了研究者的极大关注[77]。已有研究表明，人类细胞的脱靶概率远比水稻和大豆高[78-79]。目前认为非同源性重组的修复机制可能是造成脱靶现象发生的原因之一[80]，错配的位点大多发生在靶位点富含AT或A、T重复区域[64]。

目前的研究认为，通过以下几种策略可有效减少脱靶现象的发生：1）设计特异的sgRNA；2）改变Cas9核酸内切酶的剂量与sgRNA的滴度；3）Cas9的任一功能结构域发生突变形成单链切割酶，2条sgRNA与Cas9切割酶发生互作；4）减少PCR扩增循环数；5）改良CRISPR系统，如Cas9/RNP或Cpf1/ RNP。在未来，Cpf1/RNP将被用作植物基因组编辑的另一种不引入外源DNA的新策略[81]。此外，最近的研究利用dCas9-TV系统也有效抑制了脱靶现象的发生[82]。

笔者坚信通过对CRISPR/Cas系统中Cas蛋白和sgRNA的不断改进，CRISPR/Cas编辑技术必将在作物遗传改良、人类基因治疗等研究领域中显示出广阔的应用前景。