CRISPR/Cas系统由成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindrome repeat sequences)和Cas基因(CRISPR-associated genes)组成，特异性地存在于大多数细菌(60%)和古生菌(90%)基因组中，能够抵抗噬菌体对细菌的破环，被认为是细菌的适应性免疫系统[1].2013年，CRISPR/Cas9技术首次应用到哺乳动物细胞中，之后被《科学》(Science)杂志评为“2015年度十大科技突破”之首.

CRISPR/Cas9系统只需要设计一个靶向目标序列的sgRNA(single-guide RNA)就能引导Cas9核酸酶结合到特定的基因序列，并指导Cas9核酸酶切割相应的结合位点[2].与锌指核酸内切酶(zinc- finger nucleases，ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases，TALENs)基因编辑技术相同，CRISPR/Cas9系统造成基因组靶位点形成双链断裂，通过同源重组或非同源末端连接的途径进行DNA修复[3].CRISPR/Cas9技术具有操作简单、实施快捷的特点，迅速超越上一代的ZFNs及TALENs等技术，在多种生物的基因组定点编辑中得到广泛应用，如人类细胞[4]、大鼠[5]、小鼠[6]、果蝇[7]、斑马鱼[8]、酵母[9]、细菌[10]、植物[11]等.然而，Fu等[12]早在2013年即发现针对不同基因的sgRNA均可以导致不同程度的脱靶效应，潜在脱靶位点的平均脱靶效率在40%左右，此系统的安全性和靶向性也引起人们越来越多的关注.

CRISPR/Cas系统是存在于细菌及古生菌中的一种有效的抵御外来噬菌体或质粒侵袭的获得性免疫系统，主要由前导序列、多段高度保守的重复片段和间隔片段串联序列、CRISPR相关蛋白基因(Cas genes)组成.根据其基因序列及核心要素的不同，将不同物种中的CRISPR/Cas系统分成3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅰ型又可根据不同的物种分为6种亚型，Ⅱ型根据是否含有csn2或csn4基因分为2种亚型，Ⅲ型根据是否含有csm2或cmr5基因分为2种亚型.Ⅰ型的标记基因是Cas3，Ⅱ型的标记基因是Cas9，Ⅲ型的标记基因是Cas10.其中，Ⅰ型和Ⅲ型具有相似性，需要特定的Cas蛋白内切酶剪切CRISPR转录出的长RNA前体(pre-CRISPR RNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔序列的成熟crRNA(CRISPR-derived RNA).crRNA与Cas蛋白聚合成多重蛋白质复合体，识别并剪切与crRNA互补的外源核酸序列[13-14].而Ⅱ型CRISPR/Cas系统结构相对简单，pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与，被认为是最小的CRISPR/Cas系统，其包括CRISPR重复间隔基序和4个(但通常为3个)cas基因(cas9、cas1、cas2、cas4或者csn2)[15].在上述三大类型CRISPR/Cas系统中，不同种类Cas蛋白的功能决定了其降解外源DNA的不同机制.基于结构简单、易于设计和实施的特点，目前研究使用的主要为Ⅱ型CRISPR/Cas9系统，用于对靶细胞中特定基因的删除、添加、激活、抑制等修饰.

pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)也被转录出来.Cas9蛋白含有2个活跃的酶切位点，包括氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH位点，其中RuvC负责非互补链的切割，HNH负责互补链的切割[16].tracrRNA协同Cas9蛋白可以产生成熟crRNA.crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的外源DNA，然后解开DNA双链，形成R环结构，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9 2个酶切位点分别对DNA双链进行切割，最终导致DNA双链断裂.tracrRNA和crRNA可以融合成为一个向导RNA(single-guideRNA，sgRNA)[17].

Cas9蛋白具有细胞核定位信号(nuclear localization signal，NLS)，能够与sgRNA结合并组装成sgRNA-Cas9复合体，对PAM区(proto spacer adjacent motif)上游的17~20 bp靶序列进行定点编辑，引起DNA双链断裂.PAM区由NGG序列构成，N为A、G、C、T中任一碱基.当DNA双链发生断裂时，细胞通过同源介导的双链DNA修复(homology directed repair，HDR)和非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)的方式进行自我修复.HDR会以另外一条同源染色体为模板，进行基因修复，HDR通常不会引起突变.但是，NHEJ的修复方式具有易错倾向，容易在断裂位点发生碱基插入或缺失，造成移码突变，引起目标基因的功能缺失[18].目前CRISPR/Cas9技术正是主要利用这一特点实现对特定DNA片段的敲除.由于人类基因组中存在丰富的NGG序列，因此该系统几乎可以靶向编辑人类基因组中的任何一种基因.

CRISPR/Cas9技术展示了其特有的优势，开创了基因编辑的新时代，这种新型基因组编辑技术已经在生物工程、医学领域、农业、环境领域的研究中得到了广泛应用.在临床治疗中，与蛋白质水平的治疗方式相比，基因治疗具有更加直接高效、成本低廉的特点.目前CRISPR/Cas9技术在医学相关领域的应用主要包括基因组功能研究、病毒疾病治疗、肿瘤基因敲除、免疫治疗等，随着研究的深入，有可能通过该技术对人类突变基因定位来治愈疾病.

慢病毒载体构建的sgRNA文库可用于筛选与肿瘤发生相关的基因.有研究者[19]利用约123 000个sgRNA组成的CRISPR/Cas9基因组文库对黑素瘤细胞中的靶基因进行编辑突变，然后通过检测T细胞对这些肿瘤细胞杀伤的敏感性，从中筛选出导致肿瘤细胞产生免疫耐受的突变基因.该研究发现，APLNR(apelin受体)基因功能缺失突变会引起患者产生免疫治疗敏感性降低；进一步研究证明，APLNR与JAK1相互作用调节肿瘤细胞中的干扰素γ应答.同时，小鼠模型中APLNR功能缺失，会降低过继免疫细胞治疗和免疫“卡控点”阻断治疗的效果[20].目前利用构建sgRNA文库，CRISPR/Cas9系统已经筛选鉴定出与癌细胞增殖[21-22]、耐药性[23-24]和转移[25]相关的关键基因.此外，通过进一步改造CRISPR/Cas9系统，建立了CRISPR激活(CRISPRa)和CRISPR抑制(CRISPRi)技术，即将Cas9带到特定的基因组位点，通过启动或终止转录来调控靶基因的表达，该技术特别适合分析非编码RNA的功能[26].目前Bester等[27]建立了CRISPRa平台，用于筛选与化疗药物抵抗相关的功能性长链非编码RNA.

CRISPR/Cas9作为一种新的基因组编辑技术已经在诸多病毒感染性疾病研究中发挥重要作用.乙肝病毒(HBV)是一种嗜肝性DNA病毒，HBV基因组DNA进入细胞核后，转化成共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)，它是病毒转录的模板，其形成意味着HBV感染的成功.由于一般的抗病毒药物难以入核，因而cccDNA难被清除，这也形成了HBV无法彻底根治的分子基础.Lin等[28]发现，CRISPR/Cas9技术可以在体内、体外对HBV基因组DNA进行有效切割，显著抑制HBV核心蛋白和表面蛋白的表达.与传统的治疗方法相比，这种新型的基因编辑技术可以破坏cccDNA，达到清除HBV的目的.此外，目前抗逆转录病毒的药物治疗只能在一定程度上抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的复制，但并不能消除潜伏感染的HIV.利用CRISPR/Cas9技术可以靶向敲除潜伏感染的HIV-1基因组，基因突变的效率可达到90% [29]，因而该技术可能具有彻底治愈艾滋病的潜力.此外，利用该系统靶向HCV[30]、HPV[31]、EBV[32]等病毒的研究，均显示可以减少病毒复制，达到减少病毒产生甚至清除病毒的疗效.

在肿瘤的形成过程中，原癌基因的激活和抑癌基因的失活发挥重要的作用.CRISPR/Cas9系统不仅可以靶向敲除致癌基因，而且在外源性DNA模板的作用下可以对突变的抑癌基因进行修复.例如，CRISPR/Cas9靶向切割非小细胞肺癌相关的癌基因EGFR，能够有效抑制非小细胞肺癌细胞的增殖及异体移植肿瘤在小鼠体内的生长，延长小鼠生存期[33].在原癌基因KRAS活化突变的胰导管腺癌模型中，利用该技术敲除KRAS基因后，细胞形态发生改变，细胞活力、克隆形成能力和成瘤率降低[34].此外，利用CRISPR/Cas9系统特异性纠正慢性髓性白血病细胞中突变的抑癌基因ASXL1(additional sex combs like 1)，能够进一步促进细胞分化，抑制细胞的增殖速率，延长荷瘤小鼠的生存期[35].本课题组在前期工作中建立了可以同时沉默原癌基因Stat3和HBV基因组CRISPR/Cas9系统，结果发现HepG2.2.15细胞基因组STAT3蛋白表达受到干扰，且HBV基因组靶位点突变显著增加，有效抑制了HBV的复制和细胞生长(未发表).这些研究提示，CRISPR/Cas9技术在肿瘤治疗中具有非常大的潜力.目前，CRISPR/Cas9系统已被用于非小细胞肺癌[33]、肝癌[36]、结直肠癌[4]、乳腺癌[37]等多种肿瘤模型，在寻找肿瘤基因治疗方面发挥着重要作用.美国临床试验数据库(clinical trials)显示，多个基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的肿瘤治疗方案正在开展临床研究(表 1)，这项技术在肿瘤基因治疗领域具有非常大的发展前景，为未来个体化靶向治疗提供了有力的支持.

近年来，免疫治疗在肿瘤等疾病治疗中发展迅速，例如嵌合抗原受体T细胞(chimeric antibody receptor engineered T cell，CAR-T)技术可以再定向和重编程T细胞，使之表达特异性肿瘤抗原受体，CAR-T细胞经纯化扩增后输入患者体内进行抗肿瘤治疗[36].目前，最成功的是针对CD19的CAR-T细胞，对化疗难治性或复发性B细胞恶性肿瘤患者可以达到完全缓解的治疗效果[36].但是，由于CAR-T淋巴细胞回输入患者体内后可通过自身具有的TCR识别宿主抗原，造成移植物抗宿主病，导致患者多器官功能衰竭.有研究利用CRISPR/Cas9基因敲除的特性，将靶向CD19的CAR基因定向插入到患者T细胞受体α链(TRAC)基因座，这样产生的CAR-T细胞不仅可以避免引起患者体内“细胞因子风暴”，消除移植物抗宿主反应，而且能够提高患者外周血T细胞中CAR表达的均匀性，增强CAR-T细胞的效能，延缓效应性T细胞的耗竭[38].基因修改的T细胞受体(gene modified TCR，TCR-T)和CAR-T技术统称为“T细胞受体重新定向”技术.有研究者将CRISPR/Cas9技术成功地与TCR替换技术联合使用，即利用CRISPR/Cas9敲除该T细胞内源性的TCR-β链的恒定区，同时利用识别肿瘤抗原的γδTCR表达载体转染T细胞.这种技术联合使用不仅使T细胞对肿瘤抗原的识别能力比单纯TCR转染提高5 000倍，而且对多种淋巴和髓系来源的血液恶性肿瘤细胞的杀伤活性明显增强[39].这些研究展示出CRISPR/Cas9基因组编辑技术推动免疫治疗发展的巨大潜力.

CRISPR/Cas9系统的特异性主要取决于sgRNA的识别序列.由于设计的sgRNA可能会与非靶点DNA序列形成错配，导致非预期的基因突变，该效应称为脱靶效应(off-target effects). sg RNA在非靶位点形成局部错配的形式分为两种情况：a.sg RNA与非靶DNA序列长度相等，只存在碱基错配；b.sg RNA与非靶DNA序列长度不等，通过形成DNA凸起或RNA凸起与其他碱基的错配[40-41].

脱靶突变可能会导致基因组不稳定，并破坏其他正常基因的功能.早期利用CRISPR/Cas9对斑马鱼基因组进行编辑时发现，有效突变可达到86%并且可以遗传给子代，同时约有1.1%~2.5%潜在靶外位点突变效率[42].在植物拟南芥中引起的脱靶效应，在其子代中表现更加明显[43].随着基因测序技术及体外寻找脱靶位点的生物化学方法的发展，如CIRCLE-seq[44]、GUIDE-seq[45]和ChIP-seq，提高了检测脱靶位点的敏感性，人们得以简便、快速、全面地对CRISPR/Cas9的脱靶突变进行鉴定，从而降低脱靶效应，进一步促进CRISPR/Cas9基因编辑系统的研究及应用.

多项研究认为，sgRNA的序列可能会引起脱靶效应.Kuscu等[41]利用染色质免疫沉淀-高通量测序(ChIP-seq)技术，在HEK293T细胞中利用无催化活性的Cas9(dCas9)结合12种不同的sgRNA，绘制出全基因组结合位点图谱，由dCas9结合的脱靶位点数量从10到超过1 000不等，而这些都取决于sgRNA的序列.Pattanayak等[46]对细胞进行体外基因编辑时报道，sgRNA序列同PAM结合区可以有多达7个碱基的错配.同先前的报道一致，利用基因组测序对Cas9核酸酶诱导的脱靶序列进行分析发现，这些sgRNA序列同PAM结合区存在多达6个碱基的错配[45].

sgRNA引导Cas9蛋白结合到靶DNA位点时，要求其下游必须有2~5nt的PAM序列.Pattanayak等[46]利用体外选择和高通量测序方法对sgRNA的特异性进行了验证，发现sgRNA-Cas9复合物的特异性依赖于sgRNA中临近PAM的7~12个碱基序列与靶基因的互补配对.非经典的PAM序列，包括NAG、NGA、NAA、NGT、NGC和NCG等，可以在gRNA/PAM结合界面处形成1 bp“隆起型”错配.虽然PAM区错配往往发生在目标序列的5′端，但也可以在3′端发生，因而不能够基于位置来预测脱靶效应[45].与该研究不同的是，Zhang等[47]发现脱靶效应与靶DNA的结合序列无关，而是与所设计的sgRNA序列和Cas9核酸酶的类型相关.作者利用gRNA与3种不同的Cas9组合对突变的靶序列进行基因编辑，比较引起靶点DNA双链断裂(DSB)的效率.他们发现，靶DNA序列突变并不影响gRNA和Cas9的切割活性，而是gRNA和Cas9共同决定了双链DNA切割的特异性.此外，不同的PAM序列，脱靶效应也不尽相同，sgRNA识别酿脓链球菌的NGG PAM序列及NAG PAM序列需要8个核苷酸，而识别嗜热链球菌的NGGNG PAM及NNAGAAW PAM序列分别需要32及256个核苷酸.因此，对PAM的依赖性增加了CRISPR/Cas9系统的特异性，需要的核苷酸越多，脱靶效应则越低.

紧邻PAM序列的DNA-RNA双链错配会损害Cas9活性.Hsu等[48]在HEK293T和HEK293FT细胞系中对700多种sgRNA和对应的脱靶位点进行了评估.结果显示，Cas9核酸酶对错配碱基的耐受能力与错配碱基数量、位置及分布有关.根据与PAM的距离，可将sgRNA序列划分为PAM近端种子区和PAM远端非种子区.与作用于PAM近端区域的Cas9核酸酶相比，在PAM远端区域的Cas9核酸酶对单碱基错配表现出更大程度的耐受性.通常单核苷酸的错配不影响Cas9活性，而在距离PAM的不同位点发生两个或更多碱基的错配，则会不同程度降低Cas9活性[40, 46, 49-50].此外，研究还发现，Cas9核酸酶切割靶基因组不受甲基化影响，这意味着切割在多个位点是有效的.

通常将sgRNA靠近PAM的10~12 bp的碱基对称为种子区，它决定sgRNA与靶点识别的特异性，其余序列在不同程度上影响脱靶效应.Ren等[51]发现sgRNA的基因编辑效率同sgRNA种子区GC含量成正比，并且sgRNA种子区序列与脱靶位点DNA序列存在3个或更多碱基错配时，脱靶效应降低甚至消失.因而在设计sgRNA序列时，可选择GC含量在40%~60%，与靶基因序列之外的基因组DNA同源性低的sgRNA序列来提高sgRNA的特异性.PAM远端的sgRNA序列可引起Cas9构像改变，促使靶点DNA断裂.当PAM远端第15个碱基为胞嘧啶时，可增加sgRNA的特异性，降低脱靶[52-53].但是，在设计PAM近端sgRNA序列时，种子区第一个碱基优选鸟嘌呤，避免选择胞嘧啶，这是由于鸟嘌呤富集的sgRNA更易折叠，形成更加稳定的结构，降低脱靶效应.

sgRNA的长度也和特异性密切相关，采用缩短的sgRNA序列，即少于20个核苷酸序列，可以有效地降低脱靶效应而不影响基因编辑效果[49, 54].然而，Kleinstiver等[55]发现缩短sgRNA序列不能增加特异性，并且可能降低基因编辑效率.因此，通过缩短sgRNA长度来降低脱靶效应的策略仍有待进一步验证.另一种增加sgRNA特异性的简单修饰，被称为“GG20”策略，即在设计sgRNA时在5′端增加2个鸟嘌呤(称为ggX20 sgRNAs)取代相应的GX19 sgRNAs，能够极大降低脱靶效应，增加特异性[56].

此外，利用在线提供sgRNA设计和off-Target评估网站，如CRISPR design tool(http://crispr.mit.edu)、ZiFiT(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)、Cas9 design(http://cas9.cbi.pku.edu.cn/)、E-CRISPR(http://www.e-crisp.org/)、Cas-offinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)、CHOPCHOP(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/index.php)[57]，同时利用本地下载安装的设计sgRNA和评估潜在脱靶位点的软件工具(如CasOT[58])，根据需要设定参数，就可以在任意给定的基因组或者序列里设计sgRNA序列或者寻找潜在的脱靶位点.

控制Cas9-sgRNA复合物的浓度是一种具有降低脱靶效应潜力的策略，即通过控制Cas9蛋白或sgRNA的表达量来减少脱靶效应.Pattanayak等[46]通过对HEK293T细胞的基因组进行切割，对5个潜在的脱靶位点进行高通量测序检测发现，序列较短、活性低的sgRNA比序列长、活性高的sgRNA更具有特异性，而高浓度的sgRNA-Cas9复合物可以切割PAM序列附近或内部位点，形成脱靶效应.Shalme等[23]利用慢病毒载体将Cas9蛋白和sgRNA转染到黑色素瘤细胞中，当Cas9蛋白稳定表达7~14 d时，1个含有3个碱基错配的脱靶位点的突变率由40%增加到50%.该研究提示，细胞持续表达Cas9将增加脱靶风险，因而可以通过Cas9蛋白的封闭抗体或抑制剂来降低Cas9活性，降低脱靶效应.尽管通过调节sgRNA和Cas9核酸酶的浓度可降低脱靶风险，但浓度降低后，相应的基因组编辑能力也会减弱[48]，因此必须考虑基因编辑效率与脱靶效应之间的平衡.现有研究认为，当gRNA:Cas9复合物比值为2:1或者3:1时，靶基因敲除效率较高，且可以有效降低脱靶效应.

通过对野生型Cas9进行改造提高CRISPR/Cas9系统的特异性.一种策略是，将Cas9中的一个酶切位点失活，得到突变型D10A Cas9切口酶和H840A Cas9切口酶.由于突变型Cas9只能对单链进行切割，因而需要2条sgRNA同时引导，在DNA不同的链产生2个临近的切口，才能引起双链DNA断裂.所以，只有2条sgRNA均发生错配时才会发生脱靶，这极大降低了脱靶效应.利用Cas9单切口酶和“paired-gRNAs”进行基因组编辑，这一策略能有效提高基因敲除效率，显著降低细胞系中的脱靶效应(约50~1 500倍)，且该方法适用于人类细胞、动物、植物、细菌等多种生物体模型的基因组编辑[59-60].

另一种与上述策略相似，是将Cas9蛋白的核酸酶结构域进行突变，产生灭活的dCas9，然后与FokⅠ核酸酶结合形成融合蛋白质(Cas9-FokⅠ)，当2个sgRNA引导Cas9-FokⅠ结合到相距15~20 bp的靶DNA区域，FokⅠ蛋白发生二聚化而激活，对中间的DNA进行切割，形成双链末端断裂[61].应用这种核酸酶可以诱导人类细胞产生高效的基因编辑，并且极大地降低脱靶突变水平.目前已开发出Cas9蛋白的高度特异性的突变体，可以避免野生型Cas9诱导的绝大多数脱靶突变.例如增强型突变体eSpCas9[62]、高保真突变体SpCas9-HF1[55]、高精度突变体HypaCas9[63]等.因此，研究者可以通过选择优化的Cas9核酸酶来降低脱靶效应.

目前Cas9可以通过DNA质粒、mRNA和蛋白质三种方式传递到靶细胞中，其中直接递送Cas9 mRNA和蛋白质这两种方式可显著降低脱靶效应[64-65].CRISPR/Cas9递送方式主要包括物理方法(显微注射、脂质体转染、电转、高压尾静脉注射等)和病毒载体(慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等).已有的研究表明，利用Cas9/sgRNA核糖核蛋白(ribonucleoproteins，RNPs)递送系统不会在被编辑的细胞基因组中插入外源DNA序列，可有效减少脱靶效应[66].在对11个脱靶位点进行评估时发现，与质粒DNA转染方式相比，阳离子脂质体包裹的RNPs递送系统将SpCas9蛋白的特异性提高近10倍[67].在一项类似的研究中，RNPs递送系统将两种sgRNA的在靶与脱靶效率的比值提高了约3倍[68].Cas9 mRNA或Cas9蛋白和2′-O-甲基3′-硫代磷酸酯(MS)修饰的sgRNA利用RNPs系统共转运时，能够显著提高3种靶向不同基因的sgRNA在靶与脱靶效率的比值[69].此外，纳米金粒子与阳离子聚合物复合而成的递送载体(CRISPR-Gold)可以将Cas9核糖核蛋白及供体DNA(donor DNA)递送至不同细胞中，纠正导致Duchenne型肌营养不良小鼠突变DNA，降低脱靶效应[70].利用其他的递送系统，如活性P22-Cas9纳米载体的程序化自组装系统，即将Cas9和sgRNA包装在噬菌体P22的病毒样颗粒(VLP)内，也可以实现Cas9核酸酶对dsDNA靶序列特异性切割，降低脱靶效率，这项工作展示了开发P22作为Cas9细胞特异性靶向载体的潜力[71].因此，利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，可选择RNPs、阳离子脂质体、纳米金粒子等递送载体，增加Cas9核酸酶的特异性，降低脱靶效应.

Pawluk等[72]首次发现了CRISPR/Cas9的“关闭开关”，该研究小组鉴定出3个天然存在的、能够抑制Cas9酶的蛋白质家族，这些抗CRISPR的蛋白质能够特异性阻断脑膜炎奈瑟菌Cas9酶切割DNA的能力.Rauch等[73]在李斯特菌中发现了多种称为抗CRISPRs的抑制剂，其中AcrllA2和AcrllA4 2个抑制剂能够阻断来自酿脓链球菌的Cas9酶或SpyCas9酶活性.随后，黄志伟课题组[74]针对“关闭开关”如何抑制CRISPR/Cas9系统的问题进行了研究.通过比较SpyCas9:sgRNA复合物与AcrllA4结合的晶体结构发现，AcrllA4竞争性地结合在PAM相互作用位点，阻断了SpyCas9对双链DNA底物的识别，并且AcrllA4通过封闭RuvC活性位点进一步抑制SpyCas9的核酸内切酶活性.近年来，Doudna团队[75]发现广谱的CRISPR/Cas9抑制剂AcrllC1和AcrllC3分别通过不同的策略抑制Cas9核酸酶.AcrllC1通过直接结合到Cas9酶保守的HNH催化域，从而阻止多种同源Cas9对DNA双链的切割，AcrllC3能阻断单个Cas9的活性，通过诱导Cas9的二聚化阻止其与DNA双链的结合.因此，为避免Cas9蛋白在细胞中的持续表达，可利用上述抑制剂降低脱靶效应.

除以上方法外，对sgRNA进行化学修饰也可以有效降低脱靶效应.例如，通过2-氟核糖[76]、2′- O-甲基3′-硫代磷酸酯(MS)[69]、2′，4′BNANC [N-Me]桥式核酸和LAN锁核酸[77]化学修饰crRNA，能够提高sgRNA的稳定性，增加Cas9核酸内切酶的特异性；也可以利用DNA核苷酸替换crRNA 5′和3′端的部分RNA核苷酸的策略，以形成的DNA-RNA嵌合体引导Cas9核酸酶[78]，降低Cas9核酸酶在人类基因组编辑的脱靶效应.另外，优化检测脱靶效应的方法为保证基因操作的准确性起到重要推动作用，如应用整合酶缺陷的慢病毒载体(IDLV)检测CRISPR/Cas9的脱靶效应，该方法最低可检测1%的脱靶频率[79].

CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因靶向编辑技术，因其操作简单、高效等优势，已发展成为最具前景的基因组定点修饰技术，将会在基因组筛查、药物靶点的鉴定以及肿瘤治疗等临床应用推广方面大放异彩.在体内外试验中，CRISPR/Cas9系统在肿瘤治疗方面显示出巨大潜力，多项基于CRISPR/Cas9技术的药物或者免疫治疗方案也已进入临床前研究.围绕Cas9特异性的科学态势正在迅速发展，近期在导向RNA选择、导向RNA工程，以及脱靶检测方法等方面取得了显著进步.目前，CRISPR/Cas9技术除具有基因敲除功能外，对于基因亦具有增强和矫正功能，利用这些特点科学家们已经对诸如自身免疫病以及基因异常相关的疾病开展深入研究.然而在利用CRISPR/Cas9技术进行基因治疗过程中，仍有众多问题需要谨慎对待，治疗靶点选择是否得当？治疗过程能否可控？治疗疾病范围和输送载体是否合理？这些都需要科学工作者去不断钻研和克服.诚然，在基因治疗过程中消除脱靶效应，确保临床应用的安全性是非常关键的.相信在不久的将来，CRISPR/Cas9技术终将成为精准医疗的方式应用于临床，造福人类.